脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是最严重且最难治疗的卒中形式,每年影响全球约200万人,通常预后不佳。ICH具有高发病率和死亡率。尽管在手术清除血肿方面取得了重大进展,但由于原发性和继发性损伤,脑出血的预后仍然较差。铁死亡是一种受调节的铁依赖性非凋亡性程序性细胞死亡。越来越多的证据表明铁死亡可能导致由出血性中风介导的神经元损伤。丹酚酸A(Salvianolic acid A,SAA)是从丹参中提取的主要活性成分。具有抗氧化、抗炎、抗癌、神经保护等生物活性,自古以来就被用于治疗脑血管疾病。先前的研究表明了丹酚酸A清除自由基和抑制脂质过氧化的能力。然而,它在脑出血铁死亡中发挥的功能目前尚未明确。本课题在前期研究基础上构建脑出血大鼠模型及原代皮层神经元脑出血体外模型,Erastin及RSL3诱导建立神经元细胞铁死亡模型,检测细胞铁、脂质过氧化水平等,采用Western Blot测定铁死亡关键蛋白的表达。阐明丹酚酸A对脑出血损伤的作用、对铁死亡的影响及丹酚酸A通过铁死亡调控脑出血损伤的分子机制,同时采集临床脑出血患者血液标本进行血清铁及NRF2水平检测,对确定脑出血后靶点提供重要依据。为脑出血损伤的治疗提供理论依据及新的治疗方法。第一部分:丹酚酸A通过抑制铁死亡发挥对大鼠原代皮层神经元细胞脑出血损伤的保护作用目的:明确SAA在原代皮层神经元脑出血体外模型中的作用及对铁死亡的影响;进一步印证SAA通过抑制铁死亡发挥对神经元细胞脑出血损伤的保护作用。方法:从大鼠胎鼠中提取并验证大鼠原代皮层神经元。通过更换无胎牛血清培养基,添加Hemin构建脑出血体外模型,通过CCK8测定细胞活力选取最合适的Hemin浓度。通过Erastin及RSL3诱导原代皮层神经元细胞构建体外铁死亡模型,外源性给予SAA检测细genetic analysis胞活力。外源性给予SAA,通过CCK8选取改善细胞活力最佳的SAA浓度。检测细胞内ROS、细胞铁、GSH水平及MDA水平,Western Blot检测铁死亡标志蛋白的表达。结果:1.我们在体外成功培养了大鼠皮层神经元细胞,可见典型的神经元形态,24小时后,细胞突起和分支的数量明显增加。第7天,细胞之间形成了非常密集的网络,细胞存活时间约为三周。2.当原代神经元细胞培养到第14天时,使用免疫荧光染色。发现神经元对MAP2和NSE染色呈阳性。3.使用CCK8检测细胞活力,当Hemin浓度为50μM时,可以将原代皮层神经元细胞活力降低至约50%。因此将50μM的Hemin浓度作为ICH体外模型的诱发浓度。4.使用CCK8检测细胞活力,Hemin组细胞活力显著下降(P<0.001),提示造模成功。与Hemin造模组相比,当添加SAA(30μM和40μM)后,细胞活力无显著改变。当SAA浓度达到50μM时,可以显著提升细胞活力(P<0.001)。而添加Necrosulfonamide和Z-VAD-FMK时对细胞活力无明显改善。添加Fer-1后,可以显著提升细胞活力(P<0.05)。Erastin和RSL3是目前??公认的铁死亡诱导剂,作为胞嘧啶/谷氨酸逆向转运蛋白XCT和GPX4的抑制剂。我们发现,SAA(50μM)以及Fer-1可以消除ICH体外模型中由Erastin和RSL3诱导的原代皮质神经元的死亡。5.与Control组相比,Hemin组细胞内活性氧ROS显著增加(P<0.01),SAA干预组及Fer-1组均可显著减少神经元细胞的ROS(P<0.05)。同时发现Hemin组的GSH含量显著下降(P<0.001),而细胞内Fe~(2+)含量及MDA含量显著上升(P<0.001)。SAA干预组及Fer-1组均可逆转这种改变(P<0.001)。6.与Control组相比,Hemin组将诱导保护性GPX4蛋白的耗竭,并导致下游XCT蛋白表达的代偿性增加。而SAA及Fer-1的添加可显著增加XCT和GPX4蛋白的表达量(P<0.001)。结论:SAA对大鼠皮层神经元细胞脑出血(Hemin)损伤具有保护作用。SAA可以在Hemin诱导的脑出血体外模型中提高神经元细胞活力。SAA可以在Erastin和RSL3诱导的铁死亡体外模型中增强神经元细胞活力。SAA和Fer-1可以抑制Hemin诱导的GSH的损耗及Fe~(2+)及MDA的增加,同时可显著提高XCT和GPX4的蛋白表达量。SAA对原代皮层神经元细胞体外脑出血(Hemin)损伤的保护作用是通过抑制铁死亡发挥的。第二部分:SAA对大鼠脑出血损伤的作用及对铁死亡的影响目的:明确SAA对大鼠脑出血损伤的作用,探索SAA对铁死亡关指标的影响方法:选取96只SD大鼠随机分为4组:假手术组(SHAM)组、脑出血(ICH)组、ICH+丹酚酸A(SAA)组、ICH+铁抑素1(Fer-1)组。将胶原酶IV(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)立体定向注入大鼠的右侧纹状体以建立脑出血大鼠模型。使用Longa评分和Bederson评分对ICH引起的神经功能损伤进行量化。FPT(前肢放置测试)和CTT(转角测试)用于量化大鼠的感觉运动功能。伊文思蓝染色用以评价血脑屏障(BBB)的渗透率,大鼠取脑烘干后称重评估脑含水量。大鼠灌注后取脑,拍照评估血肿量。普鲁士蓝染色评估血肿周围的脑组织中的铁沉积。透射电子显微镜观察大鼠血肿周围脑组织线粒体的结构。铁测定试剂盒、脂质过氧化测定试剂盒和谷胱甘肽试剂盒测定大鼠血肿周围脑组织中的铁含量、丙二醛和谷胱甘肽水平。Fluoro-Jade C染色检测大鼠血肿周围神经元细胞神经退行性变。结果:1.脑出血后第1d、3d及5d,检测各组大鼠的神经行为学功能。ICH第1d时,与SHAM组相比,ICH大鼠前肢放置成功率显著降低(P<0.001);转角实验成功率显著降低(P<0.001);Bederson评分及Longa评分显著高于Sham组大鼠(P<0.001);Longa评分。SAA组可以改善鼠前肢放置成功率(P<0.01),而Fer-1组可以缓解Bederson评分的升高(P<0.05)。ICH第3d时,与SHAM组相比,ICH大鼠前肢放置成功率显著降低(P<0.001);转角实验成功率显著降低(P<0.001);Bederson评分及Longa评分显著高于Sham组大鼠(P<0.001)。SAA组和Fer-1组均可增加前肢放置成功率及转角实验成功率(P<0.05)。同时对Bederson评分及Longa评分的改善均显著(P<0.05)。ICH第5d时,与SHAM组相比,ICH大鼠前肢放置成功率显著降低(P<0.001);转角实验成功率显著降低(P<0.001);Bederson评分及Longa评分显著高于Sham组大鼠(P<0.001)。SAA组显著提升了前肢前肢放置成功率(P<0.001)及转角实验成功率(P<0.001),并且可明显减低Bederson评分(P<0.01)及Longa评分(P<0.05)。而Fer-1组与ICH组相比,可增加前肢放置成功率及转角实验成功率(P<0.01)。同时对Bederson评分及Longa评分的改善均显著(P<0.05)。2.SD大鼠在脑出血造模后5天被处死,灌注取脑后切成约1mm厚的脑片,发现SAA组和Fer-1组大鼠血肿体积明显减少。HE染色示ICH组血肿周围脑组织细胞明显水肿坏死,细胞排列不规则,细胞外间隙增大,炎性细胞浸润明显。然而,与ICH组相比,SAA组和Fer-1组的病理损伤明显减少。大鼠右侧大脑半球脑含水量显示,与ICH组相比,SAA组和Fer-1组的脑含水量明显降低(P<0.05)。伊文思蓝染色评价血脑屏障的渗透率,发现与SHAM组相比,ICH组内的外渗显著扩大(P<0.01),SAA和Fer-1可以改善外渗的恶化(P<0.05)。3.由于铁死亡会导致线粒体的形态变化,使用透射电子显微镜观察各组线粒体结构,发现SAA组和Fer-1组可以显著改善ICH组线粒体嵴丢失和外膜破裂的情况。FJC染色可以定位神经细胞、树突、轴突和末端的变性。发现ICH组大鼠FJC阳性细胞的数量明显增加(P<0.05),SAA和Fer-1的处理可以显著减少FJC阳性细胞的数量(P<0.05)。我们使用普鲁士蓝染料来检测铁在血肿周围脑组织中的沉积,与SHAM组相比,ICH组中的铁沉积明显增高(P<0.001),然而,SAA组和Fer-1组均起到了逆转作用(P<0.001)。4.为了确定SAA对大鼠ICH模型中铁死亡的影响,我们评估了MDA、GSH和铁离子的积累。与SHAM组相比,ICH组的GSH含量显著下降(P<0.001),而细胞内铁离子含量及MDA含量显著selleck LEE011上升(P<0.001)。SAA干预组及Fer-1组均可逆转这种改变(P<0.01)。结论:SAA对脑出血损伤具有保护作用,外源性给予SAA可以降低ICH大鼠神经功能损伤,缩小脑出血血肿体积;SAA可以减轻脑出血损伤引起的脑组织水肿、血脑屏障的渗透、线粒体改变、铁沉积、MDA水平增加和神经元变形。SAA可以抑制ICH大鼠铁死亡。第三部分:丹酚酸A通过AKT/GSK-3β激活NRF2影响铁死亡目的:研究SAA调控大鼠原代皮层神经元细胞铁死亡的相关机制。方法:1.通过网络药理学搜索潜在的SAA目标,从OMIM、GEN-ECARDS、CBI-Gene和DINET数据库中共获得1546个ICH相关基因,构建SAA-target-ICH网络,构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。使用Cytoscape软件中的Cytohubba模块用于查找HUB基因,并通过Matascape进行了GO和KEGG分析。使用Auto Dock Vina对排名前10位的靶蛋白和SAA进行分子对接,使用热图可视化10个核心目标蛋白和SAA的最强亲和力的对接分数。使用Pymol对最佳对接亲和力的前3的目标蛋白大分子和SAA分子进行可视化分析。2.使用Western Blot方法测定各组大鼠血肿周围组织AKT/p-AKT,GSK-3β/p-GSK-3β,细胞核及细胞质内NRF2,XCT和GPX4的蛋白表达量。3.使用Western Blot方法测定各组原代皮层神经元细胞AKT/p-AKT,GSK-3β/p-GSK-3β,细胞核及细胞质内NRF2,XCT和GPX4的蛋白表达量。4.原代皮层神经元用含或不含SH-6和ML385的SAA处理,以确定SAA是否介导AKT和GSK-3β的激活以及NRF2的核转移。使用Western Blot方法测定各组原代皮层神经元细胞AKT/p-AKT,GSK-3β/p-GSK-3β,细胞核及细胞质内NRF2,XCT和GPX4的蛋白表达量。5.采集临床脑出血患者血液标本进行血清铁及NRF2水平检测,对确定脑出血后靶点提供重要依据。结果:1.通过网络药理学搜索潜在GSK2118436分子式的SAA目标。从TCMSP、TCMIP、BATMAN及Ch EMBL中共发现了285个SAA的潜在目标。从OMIM、GEN-ECARDS、CBI-Gene和DINET数据库中共获得1546个ICH相关基因。共鉴定出46个潜在靶标,包括AKT、PIK3、P21、BCL2、NOX4和EGFR。Cytoscape软件中的Cytohubba模块用于查找HUB基因。网络接口图展示了这些HUB基因在网络中的连接。节点颜色越深,得分越高。我们发现AKT的得分和排名最高。根据HUB基因的结果,我们对核心靶蛋白和SAA进行了分子对接。使用Auto Dock Vina对排名前10位的靶蛋白(AKT1、PTGS2、EGFR、ERBB2、MMP9、ACE、PPARG、MMP2、ESR1、IFNG)和SAA进行了分子对接。使用热图可视化10个核心目标蛋白和SAA的最强亲和力的对接分数。目标蛋白与活性化合物之间的结合能大约在-8.0和-9.8kcal/mol~(-1)。2.使用Western Blot方法测定各组大鼠血肿周围组织AKT/p-AKT,GSK-3β/p-GSK-3β,细胞核及细胞质内NRF2,XCT和GPX4的蛋白表达量。与ICH组相比,SAA组中AKT(P<0.01)、GSK-3β(P<0.05)的磷酸化水平和NRF2的核转移显著增加。同样,与ICH组相比,SAA组的XCT(P<0.01)和GPX4(P<0.05)蛋白水平显著增加。而Fer-1组没有表现出这种能力。3.使用Western Blot方法测定各组原代皮层神经元细胞AKT/p-AKT,GSK-3β/p-GSK-3β,细胞核及细胞质内NRF2,XCT和GPX4的蛋白表达量。与Hemin组相比,Hemin+SAA组中AKT(P<0.001)、GSK-3β(P<0.05)的磷酸化水平和NRF2的核转移显著增加。XCT(P<0.05)和GPX4(P<0.001)蛋白表达的变化也同大鼠相同。而Hemin+Fer-1组没有表现出这种能力。4.原代皮层神经元用含或不含SH-6和ML385的SAA处理,以确定SAA是否介导AKT和GSK-3β的激活以及NRF2的核转位。SH-6抑制SAA诱导的AKT磷酸化、GSK-3β磷酸化、NRF2核转移、XCT和GPX4表达水平。ML385抑制NRF2核转移、XCT和GPX4表达,但对AKT和GSK-3β的磷酸化没有显著影响。5.采集临床脑出血患者血液标本进行血清铁及NRF2水平检测,发现脑出血后血清铁及NRF2水平均下降。结论:SAA可以通过诱导AKT和GSK-3β的磷酸化以及NRF2的核转移来抑制脑出血大鼠的铁死亡。临床脑出血患者血液标本进行血清铁及NRF2水平均下降。