研究背景与目的:嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性胞内寄生菌,在自然界中的天然宿主是一些水生的单细胞原生生物,当人类接触疫水后可发生机会性感染,导致一种重症肺炎称之为军团菌肺炎。进入宿主细胞后军团菌通过IV型分泌系统(T4Pexidartinib体内实验剂量SS)转运约330种效应蛋白,靶向细胞内重要生命活动从而逃避宿主免疫反应,对细菌在细胞内存活和增殖至关重要。研究发现,军团菌一个T4SS效应蛋白Leg G1通过充当Ran GTPase的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)来促进微管聚合,从而增强宿主细胞的迁移能力。然而意外的是,嗜肺军团菌却被证实会通过T4SS抑制感染细胞的运动能力,表明存在其他可以调控细胞运动性的效应蛋白,但机制一直不metabolomics and bioinformatics明。本研究即着手这一科学问题,研究军团菌未知功能效应蛋白Lem8(Lpg1290)对宿主细胞运动能力的调控作用,鉴定其真核蛋白靶点并阐明其生化活性,对军团菌致病机制做出新的补充。材料与方法:HEK293T和Hela细胞在添加了10%胎牛血清的DMEM中培养。从6至10周AZD1152-HQPA作用龄的A/J小鼠中分离骨髓细胞,使用L929细胞培养基上清诱导分化成巨噬细胞(BMDMs)。大肠杆菌菌株DH5α用于质粒构建,菌株BL21(DE3)或XL1-Blue用于重组蛋白的生产和纯化。所有大肠杆菌菌株均在37°C的LB琼脂平板或LB肉汤中生长。所有军团菌菌株均来自费城菌株Lp02和dot A-突变菌株Lp03。在N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸缓冲酵母提取物培养基(AYE)或木炭缓冲酵母提取物平板(CYE)中培养。通过同源重组方法从嗜肺军团菌基因组中敲除Lem8编码基因lpg1290,军团菌中基因表达通过转化入p ZL507质粒实现。通过生物信息学方法预测Lem8的蛋白结构和酶活性;通过酵母毒性实验检测Lem8及其突变体对真核细胞的毒力;通过酵母双杂交、免疫共沉淀和GST pulldown实验检测Lem8及其突变体与14-3-3ζ蛋白的结合;通过Western blot检测Lem8、14-3-3ζ、Phldb2、ICDH、Tubulin、PGK以及GFP、HA、Flag、GST和His蛋白的表达;通过免疫荧光染色检测Lem8和Phldb2在细胞内的分布;通过亲和层析的方法从大肠杆菌中纯化Lem8和14-3-3ζ蛋白;通过体外生化反应检测Lem8的半胱氨酸蛋白酶活性,并通过质谱的手段鉴定Lem8自切割的位点;通过划痕实验检测军团菌感染或Lem8转染对细胞迁移能力的影响。结果:通过生物信息学分析发现,Lem8蛋白序列上存在一个Cys280-His391-Asp412结构域,可能具有半胱氨酸蛋白酶的活性,突变以上3个位点中的任何一个均可导致Lem8对酵母毒性的丧失。Lem8在体外和体内均以非磷酸化的形式结合真核蛋白14-3-3ζ,并且结合后Lem8会在自身蛋白的碳末端切下一段52氨基酸长度的肽段,形成较短的剪切体(Lem8ΔC52),此剪切体仍然与14-3-3ζ蛋白具有较强的结合能力。进一步研究发现,Lem8通过其氮端的Coiled coil结构域与14-3-3ζ蛋白结合。在结合14-3-3ζ蛋白的情况下,Lem8才具有蛋白酶的活性,在多个位点靶向剪切降解参与真核细胞运动性的Phldb2蛋白,并抑制宿主细胞的迁移能力。并且,自我剪切体Lem8ΔC52也在结合14-3-3ζ蛋白的情况下表现出蛋白酶活性,对Phldb2进行多位点剪切。敲除Lem8的军团菌对感染细胞运动性的抑制能力明显下降。结论:军团菌效应蛋白Lem8在结合宿主14-3-3ζ蛋白后发挥半胱氨酸蛋白酶活性,靶向剪切降解Phldb2蛋白,从而在感染中执行军团菌抑制宿主细胞运动能力的功能。本研究不仅揭示了一种新的14-3-3蛋白结合结构域,还阐明了军团菌干扰宿主细胞生命活动如细胞运动性的新机制。