南极磷虾(Euphausia superba)是生存在immune response南极水域中的一种数量庞大的小型虾类,其蛋白含量高,蕴含人体的必需氨基酸,是优质的蛋白源,也被誉为重要的人类后备蛋白库,但目前尚未得到充分利用,处于未完全开发阶段。海洋生存环境使得南极磷虾蛋白序列与陆生动物不同,可能蕴含多肽等大量的活性物质。本实验以提炼南极虾磷油后的蛋白残基——脱脂南极磷虾粉为原料,进行酶解,制备南极磷虾活性小分子肽,使用超滤、葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白,以抗氧化指标为判定,提升南极磷虾肽的抗氧化活性。运用质谱仪进行检测,对肽序列进行解析,利用信息生物学分析数据库对肽段活性筛选。利用南极磷虾活性小分子肽的金属鳌合特性,通过硒与活性肽螯合,制备南极磷虾富硒肽,探究对肝癌细胞Hep G2的抑制机制。主要研究内容及结果如下:(1)优化南极磷虾抗氧化肽的制备工艺,对南极磷虾粉进行成分分析,使用两种蛋白酶进行酶解,以蛋白保留率和脱色率为判定指标,对南极磷虾抗氧化肽进行活性炭脱色脱盐处理。活性炭处理的最佳条件为:选用MT粉末活性炭来做后续实验,用量为5%。脱色效果很好,能达到(92.17±0.83)%,蛋白保留程度较高,在(33.78±0.16)%。对活性炭处理后的酶解液进行超滤分离,超滤膜分离后得到>10 KDa,5～10 KDa,<5 KDa三个组分,冷冻干燥,测定各组分抗氧化活性,其中分子量<5 KDa的组分抗氧化效果要高于其他组分,实验结果证明抗氧化强的组分主要富集在低分子量多肽中。<5 KDa的组分DPPH、超氧阴离子和羟自由基清除率分别为84.74±3.61%、97.04±1.39%和61.92±5.83%(蛋白浓度10 mg/m L)。把超滤得到的<5 KDa的组分收集,进一步用Sephadex G-15分离,得到F1、F2、F3三个组分,富集冷冻干燥,测定各组分DPPH、超氧阴离子、羟基自由基清除率作用,结果显示总体抗氧化效果相对于酶解原液都有提升。(2)对葡聚糖凝胶柱分离富集的三个组分进行检测,使用液相质谱仪对结构进行鉴定。采用药物分析工具,对肽活性进行预测。分析肽的溶解度、药物的分布、吸收排泄、代谢和毒性性质。结果表明:从南极磷虾肽中三个分离样本共鉴定到属于本物种uniprot-Euphausia superba-6819的肽段有134条。肽链长度为4～40个氨基酸,其中7肽有25个,5肽达到85个,由此可见酶解效果好,可以把蛋白酶解成小分子的肽。分析南极磷虾抗氧化肽的成分组成获得二级质谱数据,selleck抑制剂对活性预测发现,大部分肽段活性高无毒。推测样品中APGELPY、DIFDPL、LDVAPL具有良好抗氧化效果,LDVAPL有强自由基清除活性,肽链LPGAIP、GPIALPE、APGELPY、RDWPEGR、GIPPAP具有抗氧化效果。可进一步人工合成验证效果。(3)以南极磷虾肽与硒自主螯合制备FG-4592细胞培养的南极磷虾富硒肽(Se-SKP)为原料,对肝癌细胞(Hep G2细胞株)进行药物处理,通过CCK8法测抑制增殖率,Hoechst33342对细胞进行染色,用ROS试剂盒检测细胞内活性氧含量,进一步进行DCFH-DA荧光探针标记检测线粒体膜电位变化,进行划痕实验验证硒肽对Hep G2的抑制增殖扩散效果,最后检测细胞内氧化应激因子。结果表明:南极磷虾富硒肽对细胞Hep G2的活性有较强的抑制作用。这种抑制作用与Se-SKP作用剂量和作用时间呈正相关。Se-SKP处理后随着暴露于细胞的药物浓度的升高,细胞会出现明显的形态改变、失活和脱落等情况。细胞经过Hoechst 33342染色后产生了凋亡的现象,被染成亮度明显的蓝色。细胞核形态变化表明Se-SKP能诱导细胞凋亡,而发挥抑制肝癌Hep G2细胞生长的作用。在南极磷虾富硒肽抑制癌细胞增殖过程中,可以通过活性氧的上调来诱导细胞凋亡。大量的ROS累积可导致细胞线粒体膜电位的降低,进而诱导线粒体依赖性凋亡。细胞暴露于Se-SKP中,细胞线粒体膜电位下降,从而破坏线粒体膜系统的功能诱发癌细胞凋亡。划痕实验证明Hep G2不仅能诱导细胞凋亡也能直接抑制癌细胞的增值扩散。最后不同浓度Se-SKP处理后能不同程度的降低Hep G2细胞的SOD活性和GSH、CAT的含量,并提高细胞外液的MDA含量和LDH活性,并且呈时间浓度依赖性,说明Se-SKP能破坏癌细胞的氧化还原平衡,损伤其细胞膜,进而诱导细胞凋亡。