背景:可卡因是一种具有中枢神经系统刺激作用的生物碱,具有极强成瘾性,其滥用是全球范围内的社会及健康问题。但可卡因的成瘾解毒缺乏有效治疗方式,通过高活性可卡因代谢酶快速将其代谢清除是目前有希望的解毒手段。可卡因体内半衰期短,经肝脏代谢后有约45%被水解为体内半衰期更长、毒性更强的苯甲酰芽子碱(benzoylecgonine,BZE),是可卡因长期毒性的主要源头。然而,现有的高效可卡因水解酶无法有效降解BZE,限制了可卡因中毒酶法治疗的实际效果。课题组在前期研究中首次证明细菌可卡因酯酶(bacterial cocaine esterase,Coc E)可将BZE降解为无毒的产物。对其进行初步改造,设计的Coc E五重突变体V116K/T172R/G173Q/L196C/I301C(命名为BZEase1)对于BZEMRTX1133体内的催化效率相对于野生型Coc E(wild-type Coc E,WT Coc E)有210倍提高(WT Coc E,k_(cat)/K_M=5.84×10~4min~(-1)M~(-1);BZEase1,k_(cat)/K_M=1.43×10~7min~(-1)M~(-1))。此外,BZE和重要的神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)具有结构相似性,Coc E被证实也可水解ACh,其潜在胆碱能副作用也是进一步开发所需考量的问题。因此,开发用于可卡因彻底解毒的BZE代谢酶不仅需对可卡因有毒代谢产物BZE具有高催化活性,还应提高其底物专一性。目的:基于“结构解析-催化机制研究-智能设计”迭代优化方案改造Coc E使其进一步提高对BZE的催化活性,降低对ACh的水解作用,提高Coc E的底物专一性,提升其用于可卡因彻底解毒治疗的成药性。方法及结果:1.基于野生型Coc E晶体结构和分子动力学模拟研究Coc E催化BZE水解的反应机理,确定了酰基化为反应限速步骤。分析活性中心关键氨基酸与底物在限速步过渡态的相互作用,用CHARMM构建突变体的初始坐标,计算各种突变体的近攻构象总氢键能。在之前设计的五重突变BZEase1基础上将Coc E-BZE结合模型中产物周围第51位丙氨酸(Ala51)突变为疏水性氨基酸可提升Coc E与BZE结合过渡态的稳定性,有希望提高催化效率。通过定点突变、表达和纯化突变体,高效液相色谱法检测Coc E水解BZE的产物苯甲酸(benzoic acid,BA)生成量对设计的5个突变体酶进行活性表征,证明将丙氨酸突变为亮氨酸(A51L突变)即A51L/V116K/T172R/G173Q/L196C/I301C(BZEase2)与BZE之间的亲和力提高了144倍,即K_M降低了144倍(BZEase2,K_M=35.7μM;WT Coc E,K_M=5153μM),k_(cat)提高了约3倍(BZEase2,k_(cat)=890min~(-1);WT Coc E,k_(cat)=301.2 min~(-1)),整体催化效率k_(cat)/K_M提高了427倍。通过突变BZEase2的催化三联体中117位丝氨酸并且除去跨亚基二硫键的L196C和I30medium entropy alloy1C两个突变,构建Coc E突变体(A51L/V116K/S117A/T172R/G173Q)与BZE进行共结晶,由于此突变体催化活性未破坏完全,最终得到分辨率为2.20(?)的Coc E-BA复合物晶体。该突变体结构与野生型酶结构没有显著的区别,活性中心关键残基构象与模拟结果一致,为我们的理论计算提供支持。2.BZEase2对体内BZE的代谢和清除在雄性SD大鼠中进行了表征。首先,尾静脉注射2 mg/kg BZE,1分钟后注射生理盐水或者0.2 mg/kg或1 mg/kg的BZEase2。在注射生理盐水或酶后不同时间点从股静脉采血75μL,并立刻与100μL 250μΜ对氧磷相混合以阻止BZE进一步降解。用已经建立的高效液相色谱检测方法对处理后的血样中BZE及其代谢物BA进行定量测定。结果表明,在大鼠体内,BZEase2剂量依赖性地加速BZE水解为苯甲酸和芽子碱。单次常规剂量的BZEase2(1 mg/kg,iv)可以在两分钟内消除几乎所有的BZE。3.通过野生型Coc E晶体结构以及得到的Coc E突变体-BA晶体结构,构建Coc E与ACh结合模型,动力学模拟和自由能计算解析了Coc E催化ACh水解的基本反应机制,确定去酰化过程是反应的限速步骤。基于ACh与BZE分子电荷分布和净电荷的不同,通过重新构建活性位点的静电环境,在五重突变体BZEase1基础上设计13个突变体,获得蛋白后测试它们对BZE和硫代乙酰胆碱(ATC,评价胆碱酯酶活性常用底物)的催化活性,进行初步筛选。结果表明将Coc E-ACh结合模型中不直接与ACh相互作用第51位丙氨酸(Ala51)突变为带正电荷的精氨酸(A51R突变,BZEase3)和赖氨酸(A51K突变,BZEase4)可以显著降低Coc E对ACh的催化效率,BZEase3和BZEase4在37℃反应条件下的胆碱酯酶活性CH-223191相对WT Coc E降低了1022和1328倍;对BZE的催化效率虽然相较于高活性突变体BZEase2有所降低,但相对WT Coc E分别提高了44和39倍;在BZE和ACh生理浓度下,三个突变体酶水解BZE和ACh的相对反应速率与WT Coc E相比,分别有14622、27139和34977倍的大幅提高。以上数据表明设计的突变体显著提升底物专一性,充分降低了对胆碱能系统的影响。结论:基于“结构解析-催化机制研究-智能设计”迭代优化方案,经过理性设计得到的Coc E六重突变体BZEase2(A51L/V116K/T172R/G173Q/L196C/I301C)水解BZE效率相较于野生型Coc E提高了427倍,并且单次注射常规剂量的BZEase2可以在两分钟内消除大鼠体内几乎所有的BZE,这为发展可卡因彻底解毒的BZE代谢酶提供更高的起点。通过引入A51R和A51K突变,重新构建活性位点的静电环境,大大降低代谢酶与ACh的结合能力,显著提高对BZE较ACh的催化特异性。设计的BZEase3和BZEase4对ACh的催化效率较野生型酶低1000倍以上,生理条件下对BZE较ACh的底物选择性提高～30000倍,因此显著提升BZE代谢酶的催化专一性,其胆碱能影响几乎可忽略不计。这项研究从催化活性和底物选择性角度改造Coc E,提升了其酶学性能,为实现可卡因彻底解毒提供了高效、专一的BZE代谢酶。