目的:1.研究铁死亡对心肌细胞衰老的影响并探讨其机制;2.研究Klotho对心肌细胞衰老和铁死亡的影响。方法:(1)选取2月龄、8月龄和14月龄的雄性BALB/C小鼠,称取小鼠心脏和体重的重量,计算心脏与体重的比值;采用HE染色观察心脏组织形态学变化,微板法检测血清中丙二醛(MDA)含量,普鲁士蓝+DAB染色检测心脏组织中铁离子水平,Western Blot检测小鼠心脏组织中Klotho蛋白的表达及铁死亡相关蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)和衰老相关蛋白P53、P21表达水平。(2)使用不同浓度D-半乳糖(D-gal)诱导H9C2细胞损伤从而制备心肌细胞衰老模型,在光镜下观察细胞形态和数量的变化,采用MTT法检测细胞活力,确定后续实验采用的D-gal浓度。(3)使用D-gal和铁死亡抑制剂处理心肌细胞后,采用MTT法检测细胞活力,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平,硫代巴比妥酸法检测细胞内MDA含量,Western Blot检测SLC7A11、GPx4、P53蛋白表达水平;微量法检测细胞内衰老标记物β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性,观察铁死亡对心肌细胞衰老的影响。(4)靶向抑制P53研究P53/SLC7A11/GPx4信号轴对细胞衰老的影响。采用微板法检测不同处理条件下细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,Western Blot检测SLC7A11、GPx4、P53蛋白表达水平,微量法检测细胞内β-GAL活性。(5)使用Dgal和Klotho处理心肌细胞,采用MTT法检测细胞活力,透射电镜观测细胞内线粒体结构变化,DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平,微板法检测细胞内GSH含量,硫代巴比妥酸法检测细胞内MDA含量,微板法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western Blot检测SLC7A11、GPx4、P53和P21蛋白表达水平,微量法检测细胞内β-GAL活性,研究Klotho对细胞衰老和铁死亡的影响。(6)使用铁死亡诱导剂Erastin和Klotho处理心肌细胞,MTT法检测细胞活力,观确认细节察Klotho对Erastin诱导的细胞活力影响。结果:(1)与年轻小鼠相比,老年组小鼠心脏体积增大,心脏重量与体重比值增加(P<0.05);HE染色结果显示,老年组小鼠心脏组织出现心肌细胞肥大,排列紊乱,细胞边界不清晰病理学改变;血清中MDA水平增加(P<0.05);普鲁士蓝+DABATP bioluminescence染色显示老年组小鼠心脏组织中铁离子增加(P<0.05);Western Blot结果显示老年小鼠心脏中铁死亡相关蛋白SLC7A11和GPx4的表达水平降低,衰老相关蛋白P53和P21的表达增加,Klotho蛋白的表达降低(P<0.05)。(2)与Control组相比,随着D-gal浓度增加,在光镜下心肌细胞形态出现扁平肥大样改变;MTT结果显示,细胞活性随着D-gal浓度升高而降低(P<0.05)。选用D-gal浓度为20mg/m L处理心肌细胞,发现与Control组相比,D-gal组中ROS、MDA含量增加(P<0.05);Western Blot结果显示D-gal组SLC7A11、GPx4蛋白表达下调,P53蛋白表达上调(PPCI-32765分子量<0.05);β-GAL活性增强(P<0.05)。(3)与D-gal组相比,给予D-gal和铁死亡抑制剂(Fer-1)处理组,细胞活力增加(P<0.05);ROS、MDA含量下降(P<0.05);SLC7A11、GPx4蛋白表达水平上升,P53蛋白表达下降(P<0.05);β-GAL活性下降(P<0.05)。(4)与D-gal组相比,Western Blot结果显示,D-gal和P53抑制剂Pifithrin-α组P53蛋白表达减少,SLC7A11、GPx4蛋白表达增加(P<0.05);细胞内GSH含量增加(P<0.05);细胞内β-GAL活性降低(P<0.05)。(5)与D-gal组相比,MTT法结果显示,D-gal和Klotho蛋白处理组的细胞活力升高(P<0.05);细胞内ROS、MDA含量降低,GSH、SOD含量升高(P<0.05);Western Blot结果显示,给予Klotho处理后,SLC7A11、GPx4蛋白表达增高,P53、P21蛋白表达减少(P<0.05);β-GAL活性降低(P<0.05)。透射电镜观察发现D-gal组线粒体嵴减少和线粒体肿胀等现象,而给予Klotho处理后心肌细胞线粒体结构破坏减轻。(6)与Control组相比,Erastin处理组心肌细胞活力降低,而Erastin和Klotho蛋白处理组细胞活力升高(P<0.05)。结论:铁死亡参与心肌细胞衰老的过程,Klotho可以抑制心肌细胞铁死亡,延缓细胞衰老,其机制可能由P53/SLC7A11/GPx4靶向介导。