小球藻(Chlorella)是一种绿色单细胞藻类,含有丰富的蛋白质,可作为生物活性肽的良好材料。生物体内活性氧过多会发生氧化应激反应,导致细胞或组织损伤。正常情况下内源性抗氧化防御系统起主导作用,但外源性抗氧化剂对于维持氧化损伤和抗氧化防御之间的自由基稳态同样至关重要。本文以小球藻为原料,通过酶解法制备小球藻蛋白抗氧化肽,探讨了消化过程中小球藻蛋白抗氧化肽的结构特征变化(微观结构、二级此网站结构以及氨基酸含量)及抗氧化活性,并对其进行分离纯化鉴定。研究内容及结果如下:(1)采用水提醇沉法提取小球藻脱脂粗蛋白,筛选四种蛋白酶应用于小球藻脱脂粗蛋白的酶解反应,确定最佳水解酶为碱性蛋白酶。通过单因素和响应面实验优化小球藻脱脂粗蛋白的酶解条件,得到最佳工艺条件:酶解温度55℃,p H值8.75,酶底比2.15%,在此条件下得到的酶解产物DPPH、ABTS、羟自由基清除率和亚铁离子螯合率分别为53.19±0.99%、76.86±0.28%、53.39±1.74%、22.56±2.97%。(2)利用INFOGEST模型对不同分子量小球藻多肽M_3(>3 k Da)和L_3(<3k Da)进行体外模拟消化,M_3和L_3多肽在胃肠消化过程中呈现网状结构,并且在胃肠道酶诱导下二级结构以β-折叠为主,赖氨酸表现出较好的耐消化性。L_3在胃部表现出更强的抗氧化活性,对DPPH自由基清除能力、亚铁离子螯合能力分别达到64.29±2.97%、71.68±2.97%,经过胃肠阶段消化后,疏水性氨基酸大量释放导致L_3多肽抗氧化活性下降,但L_3始终高于M_3。因此,分子量更小的L_3多肽表现出更好的胃肠消化稳定性和抗氧化活性。(3)小球藻抗氧化肽经超滤、Sephadex G-15凝胶色谱层析分离纯化后,所得C1组分(4 NK cell biologymg/m L)对DPPH自由基清除能力、亚铁离子螯合能力分别为59.62±1.29%、49.78±1.55%。经LC-MS/MS鉴定得到152种肽序列,通过肽活性评分和自由基清除活性预测及分子对接进一步筛选,最终确定了6种肽序列,并预测了多肽的理化性质、毒性和致敏性等性质,其中多肽SGHHKPL具有良好的消化稳定性、无Proteasome抑制剂毒性且水溶性好,SLPGGYGL、WHMHKTF无毒性且致敏性小,有望成为安全有效的抗氧化剂。