扁蓿豆(Medicago ruthenica)是我国北方地区重要的乡土草种,在草原生态修复、苜蓿遗传改良育种、干旱且寒冷地区饲草供给等方面具有较高的应用价值,是我国非常宝贵的战略资源。该优良草种花期持续期较长,荚果成熟期裂荚、落粒性状明显,不仅给种子收获带来不便,影响种子产量,也制约了其在草地农业生产和退化草原生态修复中的推广与应用。探索了解扁蓿豆荚果的裂荚机理,对有效控制荚果开裂、抗裂荚新品种的选育,解决种子生产实际问题具有重要的理论指导意义。前期研究发现,扁蓿豆荚果成熟后仅沿着腹缝线开裂,果皮不发生螺旋状扭曲,腹缝线离区亦无异常木质化的细胞结构,该裂荚过程与其他已报道的豆科作物裂荚机制不同。在此基础上,论文以选取裂荚种质(裂荚率≥76%)和低裂荚种质(裂荚率<10%)为实验材料,通过比较荚果果皮发育过程中微观解剖结构、生理生化特征、转录组等方面的差异,以综合探究扁蓿豆荚果裂荚机理,筛选裂荚性状相关的差异表达基因;同时系统性筛选扁蓿豆各试验条件下的最佳内参基因,以便今后进一步明确与裂荚相关的基因表达与功能特征,为扁蓿豆抗裂荚材料的分子育种及种子繁育推广提供依据。主要研究结论如下:(1)EF-1a是扁蓿豆中表达稳定性综合评价中最佳的候选内参基因。为了今后更好利用实时荧光定量PCR分析研究调控裂荚特性相关的基因表达与功能,需要在不同基因型、不同发育阶段、不同环境胁迫及不同组织等处理下,使用五个评估软件,对9个候选内参基因(EF-1a、a-TUB、b-TUB、ACT、U6 sn RNA、5.8S r RNA、5S r RNA、18S r RNA、GAPDH)的基因表达稳定性做综合性分析与评估。EF-1a在Ref Finder软件综合性评估中排名较好。(2)荚果果皮失水与高度木质化的内果皮促进了荚果的主动开裂。扁蓿豆荚果发育期持续36d。通过对荚果的动态发育观察,发现在荚果发育中期(开花后第12至16d),裂荚材料荚果内果皮木质化程度更高,石细胞的细胞壁更厚。荚果发育后期(开花后第20至28d),裂荚材料中果皮发生失水现象,中果皮薄壁细胞皱缩在一起甚至消失,内果皮成破碎状。低裂荚材料中果皮仍可见、内果皮基本完整。说明Mass media campaigns果皮失水、高度木质化的内果皮与裂荚的发生密切相关。(3)果皮主要成分及其相关生理过程对裂荚的发生起辅助作用。通过对荚果生理特征的测定与比较,发现裂荚材料荚果果皮含水量较低,纤维素含量、半纤维素含量和木质素含量较高。裂荚材料荚果果皮主成分相关的合成酶活性(Ces A、PAL、4CL、CAD和POD)较高。裂荚材料荚果果皮内细胞壁相关水解酶(PG和CE)活性也较高。说明果皮主要成分及其合成酶活性增强间接辅助了荚果的主动开裂,水解酶活性增强则有助于荚果的被动开裂。(4)苯丙烷代谢通路是影响扁蓿豆裂荚性状的重要代谢途径。利用RNA-seq技术分析了裂荚材料和低裂荚材料荚果发育的四个时期内差异基因。GO功能注释结果显示,共有17,072条unigene和2,706个差异表达基因匹配代谢过程(metabolic process),生物过程类别中排名第一。KEGG富集结果显示,分别有498条unigene和91个差异表达基因注释到苯丙烷生物合成通路(ko00940),在代谢类别中排名较高,苯丙烷代谢是裂荚性状的重要代谢通路。针对苯丙烷代谢通路,共筛选到58个与木质素合成有关的差异表达基因,大部分相关基因在裂荚材料荚果果皮中明显上调表达。当木质素相关合成基因强烈表达时,苯丙烷代谢分支类黄酮合成基因LEE011 MW表达则被抑制,为扁蓿豆裂荚性状调控网络构建了重要基因表达信息。试验进一步选取19个与木质www.selleck.cn/products/Dasatinib素合成相关的差异表达基因,对转录组结果进行实时荧光定量PCR验证,转录组和q RT-PCR的线性拟合程度较好,转录组数据精准可靠。(5)裂荚性状依赖转录因子的正调控和生长素的负调控。共筛选到23个NAC、74个MYB、39个WRKY和46个b HLH差异表达基因,均表现为上调差异表达基因数目大于下调差异表达基因数目,其差异基因表达模式与木质素合成基因的表达模式变化相吻合,是扁蓿豆裂荚性状的正调控因子。5个生长素生物合成有关的差异表达基因,均显示下调表达,与木质素生物合成基因的表达模式变化和细胞壁水解酶活性变化相反。生长素是扁蓿豆裂荚性状的负调控因子。(6)花瓣木质素含量高低可提前预判扁蓿豆的裂荚性。木质素合成基因和类黄酮合成基因在低裂荚-黄花型材料中均显示下调表达,与低裂荚材料相似。与裂荚材料木质素合成基因表达时间变化总体相反,但与开花后第16d的类黄酮合成基因表达模式相同。结果表明,花、果的颜色无法作为判断扁蓿豆是否具有高裂荚性的指标,但木质素含量可以作为预测扁蓿豆荚果是否开裂的预判指标。扁蓿豆抗裂荚材料的田间预筛选时期可提前至盛花期,大大缩短了田间抗裂荚材料选育进程。综上所述,论文首次较系统的分析了扁蓿豆荚果果皮对裂荚的影响。研究发现,果皮含水量降低和内果皮高度木质化促进了荚果的主动开裂,细胞壁合成酶活性增强间接影响了裂荚性状,细胞壁水解酶活性增强有助于荚果的被动开裂,苯丙烷代谢通路是影响扁蓿豆裂荚性状的重要代谢途径,与木质素合成相关的转录因子为扁蓿豆裂荚性状的正调控因子,而生长素则为裂荚性状的负调控因子。本研究基本阐明了扁蓿豆裂荚机理,研究结果对降低裂荚性状带来的种子生产损失具有重要意义。