背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎和进行性关节破坏为特征的自身免疫病,其致残致畸率高,严重危害国民健康。关节滑膜组织过度增生是RA始动环节,也是贯穿RA疾病进程的主要特征之一,而成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)在关节炎症、滑膜增生、软骨及骨侵蚀破坏方面起着关键作用。本课题组前期研究证实,外源selleck抑制剂性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植可改善RA动物模型及患者滑膜增生及骨侵蚀~([1])。近年来研究发现,滑膜间质中也存在MSCs(SM-MSCs),成软骨潜能较脐带MSCs更强~([2])。体外研究也显示其具有抑制T细胞增殖的能力~([3]),因此被认为有助于维持和修复关节组织~([4])。然而,为何RA患者自体SM-MSCs不能有效阻止持续关节炎症、进行性骨侵蚀?SM-MSCs在RA滑膜炎发生发展中作用如何,其滑膜寻找更多增生是否源于SM-MSCs的病态转变?SM-MSCs与生物学性状相似FLSs是否为同一种细胞或同一细胞的不同发育阶段,决定SM-MSCs命运的关键基因是什么?目前尚无相关研究。目的:1、揭示RA滑膜组织的异质性以及SM-MSCs生物学性状、功能变化;2、明确胶原诱导性关节炎(collagen inducedarthritis,CIA)小鼠在关节炎症发生发展中SM-MSCs亚群变化及分化谱系特征,探索SM-MSCs与FLSs之间的关系。方法:1、RA患者与正常对照组滑膜组织转录组测序与分析获取RA及正常对照组滑膜组织,通过转录组测序检测两组滑膜组织的异质性。2、RA患者与正常对照组SM-MSCs生物学性状及功能比较免疫荧光法检测滑膜中表面抗原CD44、干性转录因子OCT4、SOX2表达;体外培养并鉴定SM-MSCs,免疫荧光、PCR法检测干性基因表达,CCK8法检测增殖能力,Transwell法检测侵袭能力,划痕实验检测迁移能力,混合淋巴细胞实验检测免疫调节能力,染色法与RT-PCR法检测分化能力。3、不同分期CIA小鼠滑膜组织转录组测序与分析将DBA/1J小鼠随机分为正常对照组,早、中、晚期CIA小鼠,将小鼠后肢膝关节滑膜组织行普通转录组测序,明确模型各阶段滑膜组织基因表达异质性。4、CIA小鼠滑膜组织单细胞转录组测序及分析将4组小鼠滑膜组织行单细胞转录组测序,根据marker基因表达将FLSs与SM-MSCs合并为广义的FLSs亚群进行聚类分析,分析FLSs亚群在各组中分布情况;通过拟时间序列分析,解析关节炎发生发展中FLSs亚群变化及谱系分化情况。5、关键基因验证将第一部分与第三部分滑膜转录组学差异基因进行交集,筛选富集于单细胞转录组分析UMAP中FLSs的交集基因作为目的基因,用RT-q PCT法在体外培养的RA与对照组SM-MSCs细胞中进行验证。结果:1、RA患者与正常对照组滑膜组织转录组测序与分析(1)滑膜组织病理:与正常对照组相比,RA组滑膜组织显著增生,间质疏松、水肿,慢性炎细胞浸润,大量新生血管形成,纤维素沉积。(2)两组滑膜组织转录组差异基因分析:RA患者与健康对照组滑膜组织差异基因功能富集在细胞外基质、细胞迁移调控、炎症等通路。(3)靶基因热图分析:RA组滑膜中干性基因SOX10表达低于对照组,而PODNL1、BHLHE22、PERLP、AEBP1、LTBP2,AMTN、NELL1、CLIP2基因表达增加。2、RA患者与正常对照组SM-MSCs生物学性状及功能比较(1)两组SM-MSCs体外培养及鉴定:两组SM-MSCs在体外呈贴壁生长,MSCs特异性标记CD73、CD44、CD29、CD90高表达,CD45、CD14、CD34、HLA-DR低表达,细胞核中SOX2、OCT4呈阳性表达,证实体外培养所获得的细胞为SM-MSCs。(2)两组SM-MSCs生物学性状比较:两组SM-MSCs的SOX2表达降低,OCT4表达差异无统计学意义。RA患者来源的SM-MSCs细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均高于对照组。(3)两组SM-MSCs生物学功能比较(1)免疫调节能力比较:健康对照组来源的SM-MSCs可以下调混合淋巴细胞反应培体系中TNF-α、IL-17、IFN-γ水平,上调IL-10水平;而RA患者来源的SM-MSCs可上调TNF-α、IL-17、IFN-γ水平,对IL-10水平升高作用减弱,差异均有统计学意义。两组SM-MSCs均可上调IL-6表pediatric oncology达,RA组升高更为明显。(2)分化能力比较:两组SM-MSCs在相应诱导条件下可向成骨、成脂、成软骨方向分化。与对照组相比,RA来源SM-MSCs成骨诱导后RUNX2表达更多,成脂诱导后ADD1表达较少。3、不同分期CIA小鼠滑膜组织异质性检测(1)不同分期CIA小鼠大体、影像学、病理改变:早期CIA小鼠关节出现红肿,滑膜组织炎细胞浸润,轻度滑膜增生,未见软骨与骨破坏。中期组关节红肿疼痛达高峰,滑膜组织大量增生,血管翳形成,有明显的软骨及骨侵蚀;晚期组关节红肿减轻,关节强直、畸形,滑膜组织可见大量细胞外基质形成,关节结构消失。(2)各CIA小鼠与对照组滑膜组织异质性分析(1)总体差异基因分析:上调基因富集在补体激活途径、PI3K-Akt-m TOR信号通路、炎症反应、软骨内成骨、氧化应激损伤、基质金属蛋白酶等通路。(2)各分期小鼠滑膜组织特异性基因分析:早期CIA组涉及血管生成、炎症、趋化、细胞增殖、破骨细胞分化;中期组涉及免疫反应、炎症、破骨细胞分化。晚期组基质降解、结缔组织重塑等相关基因上调,多能性和干细胞维持相关基因表达下调。(3)CIA小鼠滑膜炎发生、发展中SM-MSCs亚群变化及分化谱系研究(1)各组小鼠滑膜组织亚群分析:将FLSs细胞聚类分析得到7个细胞亚群。根据各亚群marker基因表达情况注释各亚群:FLS1-血管形成表型;FLS2-侵袭表型;FLS3-免疫细胞募集表型;FLS4-炎症表型;FLS5-纤维化表型;FLS6为未分类亚群;FLS7-SM-MSCs表型。(2)各FLSs亚群在不同分期小鼠滑膜的分布:早期CIA组小鼠FLSs中的优势亚群为FLS2、FLS3亚群,涉及免疫细胞募集及侵袭表型;而中期组为FLS1、FLS5、FLS4亚群,涉及血管翳形成、炎症、细胞外基质形成;正常对照组、晚期组FLSs细胞数量少,但部分干性相关基因表达高于早中期组。(3)SM-MSCs谱系分析:SM-MSCs(FLS7)亚群主要映射在拟时序分化轨迹树形图起始部。根据FLSs分化状态再分亚群,对各分叉亚群进行差异基因分析,注释为趋化因子表型、血管形成表型、抑制血管形成表型、纤维化表型、侵袭表型。(4)关键基因的筛选与验证将两部分转录组学测序的差异基因交集后在小鼠滑膜组织单细胞水平进行映射,提示Fibin、Creb3l1、Chrdl1、Snai1、Glis3、Aebp1、Thbs2、Gpm6b、Clec11a、Twist1、Fosl1、Medag在FLSs表达丰富。RA患者与CIA小鼠中RUNX2、CREB3L1、THBS2、CLEC11A、TWIST1基因异常表达趋势一致,且差异显著。结论:1、RA患者滑膜组织部分干性基因表达下调,炎症、趋化因子、骨侵蚀与重塑等相关基因表达上调。不同分期CIA小鼠滑膜组织基因表达谱不同:早期CIA小鼠以炎症、趋化因子、血管形成为主,中期以免疫反应、炎症、骨破坏为主,晚期组以结缔组织重塑为主要表型。2、RA患者SM-MSCs增殖、分化、迁移、侵袭能力增加,干性基因表达下调,抑炎作用减弱,甚至表现为促炎表型,成骨分化作用增强,成脂分化作用减弱。3、SM-MSCs位于谱系分化的起始端,随分化时间的推移获得血管形成、抑制血管形成、免疫募集、纤维化、侵袭表型,优势亚群的变化介导滑膜炎症的发生发展。RUNX2、CREB3L1、THBS2、CLEC11A、TWIST1的异常表达在SM-MSCs病态转变中起到重要作用。