研究背景阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种高效且临床应用最普遍的蒽环类抗肿瘤药物,可用于多种恶性肿瘤的治疗。但由于DOX所引起的氧化还原失衡,其临床应用受到时间依赖性和剂量依赖性心脏毒性的限制。因此,DOX受到了人们的广泛关注,但尚未确定有效的预防或治疗措施。DOX引起急性心脏毒性的发病率约为11%,其症状大多是可逆的。早期识别并干预对于减少其不良反应,改善患者生存质量,以获得更好的预后至关重要。外源性补充成纤维细胞生长因子1(Fibroblast growth factor 1,FGF1)可PR-171作用以减少DOX诱导的心肌细胞凋亡,从而延缓心肌纤维化的程度,显著改善左心室功能。FGF1是FGF家族的创始成员,参与广泛的生物过程,在心血管疾病中以抗氧化益处而闻名。但FGF1具有很强的促有丝分裂活性,长期使用会增加致瘤风险,这限制了 FGF1在体内的应用。如何在抑制FGF1促增殖活性的同时,发挥其心脏保护作用,仍需进一步探究。天然产物不仅可OTC medication以有效抑制细胞增殖,干扰多种致瘤信号通路,而且在治疗心血管疾病方面具有巨大优势。这提示我们可以通过寻找一种天然产物在抑制FGF1促增殖活性的前提下,进一步发挥其心脏保护作用。天然多酚类化合物白藜芦醇(Resveratrol,RES)的抗增殖特性引起了我们的关注,RES已被证明可联合其他化疗药物作为替代或辅助治疗。低剂量RES的急性治疗已被证明可以在各种疾病模型中发挥心脏保护作用。RES不仅可以预防或减缓恶性肿瘤的进展,而且能够提高DOX的抗癌效果。然而,RES是否可以在抑制FGF1促有丝分裂活性的前提下,增强DOX的抗癌效果3-Methyladenine,同时发挥其对DOX所致心脏毒性的保护作用尚不清楚。下调核因子红系 2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)的表达可进一步加重DOX诱导的心肌氧化损伤,而RES可增加NRF2的表达和转录活性,以减弱氧化应激损伤。FGF1也可通过刺激NRF2的核移位和增加抗氧化蛋白的表达来减少氧化应激。然而,RES与FGF1是否是通过激活NRF2相关信号通路来抑制DOX治疗后的心脏毒性仍需进一步探索。最近研究表明,RES是sirtuin 1(SIRT1)的有效激动剂,其对DOX诱导的氧化应激的抵抗依赖于SIRT1的激活。但大量研究指出,RES还可以调控多种其它信号通路以行使其生物学功能,即RES可以通过依赖和不依赖SIRT1信号途径发挥其保护作用。此外,有研究指出,SIRT1介导了 FGF1对DOX诱导的心脏毒性的保护作用。然而,RES与FGF1联合用药对DOX所致急性心脏毒性的保护作用是否依赖于SIRT1仍然未知,且SIRT1与NRF2之间的调控关系有待进一步阐明。研究目的1.验证RES对于FGF1促增殖活性的拮抗作用,及两者联合应用对DOX所致急性心脏毒性的保护作用。2.探究NRF2对RES和FGF1联合治疗以减轻DOX所致急性心脏毒性的介导作用。3.探究RES与FGF1联合用药对DOX所致急性心脏毒性的保护作用是否依赖于SIRT1,以及SIRT1与NRF2之间的调控机制。研究方法1.动物模型构建将八周龄C57BL/6雄性小鼠根据实验设计随机分为五组,每组6只。根据分组腹腔注射RES(10 mg/kg/day)、FGF1(0.5 mg/kg/day)或相同体积的生理盐水连续7天。7天后,单次腹腔注射20 mg/kg DOX或相同体积的生理盐水,24小时后给予各组小鼠安乐死。2.细胞模型构建用20 μMRES和(或)100ng/ml FGF1处理人肝癌细胞(HepG2)、膀胱癌细胞(5637)和乳腺癌细胞(MCF-7)24小时。利用短发夹RNA(Shorthairpin RNA,shRNA)转染技术沉默H9c2细胞中的Nrf2或Sirt1基因,然后根据分组使用1μM DOX,20 μM RES,100 ng/ml FGF1和萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)分别或同时处理H9c2细胞24小时。3.细胞活力检测使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒测定细胞的活力。4.细胞凋亡检测使用原位末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)染色检测细胞凋亡率。5.一般指标检测检测小鼠心脏组织和血清中肌酸激酶(Creatinephosphokinase,CK)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、小鼠肌钙蛋白 Ⅰ(Cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。6.组织病理学检测6.1 免疫荧光(Immunofluorescent,IF)染色检测CD68、NRF2、血红素氧合酶(Heme oxygenase-1,HO-1)和醌氧化还原酶(NAD(P)H quinone dehydrogenase 1,NQO1)的蛋白表达水平。6.2 免疫组织化学(Immunocytochemistry,IHC)染色检测小鼠心脏中细胞凋亡执行者:裂解的半胱天冬酶(Cleaved caspase-3)、SIRT1的蛋白表达水平。7.活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测使用二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)染色和2′,7′-二乙酰二氯荧光素(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)染色检测 ROS 的生成情况。8.荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,Tnfa)、白介素 1α(Interleukin-1α,Il1a)、Il1b、Il6和单核细胞趋化蛋白(Monocyte chemoattractant protein-1,Mcp1)的 mRNA 水平。9.蛋白质免疫印迹(Western blot)检测 Cleaved caspase-3、促凋亡蛋白 B 细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(BCL-2-associated X protein,BAX)、核因子κB激酶亚基抑制剂α(Inhibitor ofnuclear factor κB kinase subunit α,IKBα)及磷酸化的 IKBα(p-IKBα)、p65及磷酸化的 p65(p-p65)、超氧化物歧化酶 1(Superoxide dismutase 1,SOD1)及 SOD2、氧化氢酶(Catalase,CAT)、核内 NRF2(n-NRF2)、HO-1、NQO1、SIRT1、乙酰化p53(Acetyl-p53,Ac-p53)、乙酰化叉头转录因子(Acetyl forkhead box O1,Ac-FOXO1)及 Kelch 样 ech 相关蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein 1,KEAP1)的蛋白表达水平。10.统计学分析数据以均数±标准差(Standarddeviation,SD)表示。各组运用单因素方差分析或双因素方差分析进行比较,随后进行Tukey’s or Sidak’s post hoc test。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.RES可显著拮抗FGF1的促增殖活性CCK-8结果表明RES可以有效抑制HepG2细胞、5637细胞和MCF-7细胞中FGF1的促增殖活性。TUNEL染色结果表明FGF1处理抑制了 MCF-7细胞中TUNEL染色阳性细胞数,而RES的干预明显逆转了这一趋势。2.RES和FGF1联合应用可减轻DOX所致急性心脏毒性2.1 RES和FGF1联合应用可减轻DOX所致心肌损伤和细胞凋亡检测结果显示,与Ctrl组相比,小鼠血清中CK、LDH和cTnⅠ含量在DOX组中显著升高,RES或FGF1的干预可明显降低DOX组小鼠上述心肌损伤的指标,RES与FGF1的联合使用进一步改善上述指标。IHC染色结果表明,DOX干预使小鼠心脏中Cleaved caspase-3的蛋白表达相较于Ctrl组显著升高,RES或FGF1的单独给药降低了 DOX引起的Cleaved caspase-3蛋白表达的升高,而RES与FGF1联合用药使其表达进一步降低。Western blot检测结果显示,与Ctrl组相比,在DOX处理的小鼠心脏中,Cleaved caspase-3的蛋白表达水平增加、BCL-2与BAX蛋白表达之比降低,RES和FGF1单独用药降低了 Cleaved caspase-3的蛋白表达水平并增加了 BCL-2/BAX的比值,RES与FGF1联合给药后进一步促进了上述指标的变化。2.2 RES和FGF1联合应用可缓解DOX所致心脏炎症RT-qPCR结果表明,Il1a、Il1b、Il6、Tnfa和Mcp1的mRNA水平在DOX组中显著升高,RES或FGF1的干预可明显降低DOX组小鼠上述心脏炎症指标的表达,RES与FGF1联合用药组的改善效果更加显著。IF染色结果显示,与Ctrl组相比,DOX导致小鼠心脏中CD68的蛋白表达水平的升高被RES和(或)FGF1的治疗所降低。Western blot结果表明,小鼠心脏中p-IKBα/IKBα、p-p65/p65的比值因DOX的处理而显著升高,而RES或FGF1的单独应用使上述比值降低,DOX组中的这一趋势在RES和FGF1联合用药组被进一步抑制。2.3 RES和FGF1联合应用可改善DOX所致心脏氧化应激DHE染色结果显示,与Ctrl组相比,DOX组小鼠心脏中ROS的生成明显增加,RES或FGF1的单独给药明显减少了 ROS的生成,RES与FGF1联合给药后进一步减少了 ROS的生成。在DOX的处理下小鼠MDA水平明显增加,GSH水平显著降低,但在RES或FGF1给药组中MDA水平明显降低,GSH水平明显增加,RES与FGF1联合给药后进一步抑制了在DOX处理下上述指标的变化。Western blot结果表明,相较于Ctrl组,DOX的干预明显降低了小鼠心脏中CAT、SOD1及SOD2的蛋白表达,而RES和(或)FGF1的处理显著改善了上述指标的降低。3.RES和FGF1联合治疗提高了 NRF2在DOX诱导的心脏毒性中的活性IF染色结果和western blot结果均显示,DOX引起的小鼠心脏n-NRF2及其下游HO-1和NQO1蛋白表达明显升高,RES或FGF1的单独用药增强了 DOX引起的上述指标的变化,RES和FGF1的联合应用在此基础上进一步加强其蛋白表达。DHE染色和DCFH-DA染色结果显示,敲低Nrf2基因取消了 RES与FGF1联合应用对于DOX诱导的ROS生成的保护作用。4.RES和FGF1的联合治疗通过激活SIRT1提高了 NRF2的活性IHC染色结果和western blot结果均显示,小鼠心脏中SIRT1的蛋白表达水平在DOX组显著降低,而Ac-p53和Ac-FOXO1的蛋白表达水平明显升高,RES和(或)FGF1的治疗逆转了上述趋势。Western blot结果表明,相较于NC-shRNA组,敲低Sirt1显著降低了 DOX暴露后H9c2细胞中SIRT1及n-NRF2蛋白表达,显著增加了 Ac-p53、Ac-FOXO1、KEAP1的蛋白表达,并且取消了 RES与FGF1联合应用对DOX所致上述指标变化的改善作用。DHE染色和DCFH-DA染色结果表明,与NC-shRNA组相比,Sirt1-shRNA的使用显著增加了 DOX暴露后H9c2细胞中ROS的产生,也取消了 RES和FGF1联合治疗对H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用。5.SIRT1和NRF2之间形成正反馈环以改善DOX所致氧化应激损伤在H9c2细胞中转染Nrf2-shRNA后,与NC-shRNA组相比,Nrf2敲低组显著降低了 SIRT1、n-NRF2、HO-1及NQO1的蛋白表达,增加了 Ac-p53的蛋白表达,并且取消了 RES 和 FGF1 联合干预对 DOX 处理下 SIRT1、n-NRF2、HO-1、NQO1 及 Ac-p53蛋白水平的逆转。Western blot结果表明,在DOX处理的H9c2细胞中,敲低Nrf2基因后,SIRT1及NRF2的蛋白表达水平显著降低,Ac-p53的蛋白表达水平显著升高,加入SIRT1激动剂RES后并不能显著改变上述指标。而当DOX处理的H9c2细胞转染Sirt1-shRNA后,与NC-shRNA组相比,Sirt1的沉默使HO-1及n-NRF2的蛋白表达水平显著降低,使用NRF2激动剂SFN并不能明显改变上述指标。研究结论1.RES可以拮抗FGF1的促增殖活性,两者联合应用可改善DOX所致心肌损伤、细胞凋亡、炎症和氧化应激损伤。2.RES与FGF1联合用药是通过激活SIRT1和NRF2活性,从而改善DOX诱导氧化应激损伤。3.SIRT1和NRF2之间形成正反馈环以介导RES联合FGF1对DOX心脏毒性的改善作用。