随着生活水平的提高,人们的饮食模式朝着低脂肪和低热量的方向发展。长期过量摄入高脂饮食会损害人体健康,诱发肝细胞脂质积聚、脂肪变性、炎症和纤维化等一系列肝损伤。高脂饮食诱导的肝损伤存在多种死亡方式,包括细胞焦亡和铁死亡等等。焦亡是一种炎症性细胞死亡形式,高脂饮食会激活NOD样受体家族pyrin域3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体,导致细胞内容物释放,最终引发肝损伤。铁死亡是一种新发现的细胞死亡方式,其主要特征是铁过载和活性氧(reactive oxygen species,ROS)积累。高脂饮食会增加脂质积累和脂质过氧化,进一步加速细胞铁死亡,最终导致肝损伤。因此,针对肝细胞焦亡和铁死亡,探究高脂饮食所致肝损伤的干预手段具有重要意义。自噬是一种依赖于溶酶体的降解途径,通常被认为是细胞响应多种应激的促生存机制,并参与了肝细胞损伤和死亡过程。芹菜素是一种存在于水果和蔬菜中的天然黄酮类化合物,已有研究证实其对肝脏具有保护作用。然而,目前尚未有研究探讨芹菜素对高脂饮食诱导的肝细胞焦亡和铁死亡的保护作用。因此,本论文利用高脂饲料喂养C57BL/6小鼠构建了高脂小鼠模型,同时利用棕榈酸(palmitic acid,PA)处理AML12细胞和Hep G2细胞构建了高脂细胞模型,研究芹菜素通过激活自噬缓解高脂饮食所致肝损伤的作用机制。主要研究内容与结果如下:(1)芹菜素通过激活自噬缓解高脂饮食诱导的肝细胞脂质积聚和损伤(1)研究芹菜素对高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠肝脏脂质积聚和损伤的影响,首先对C57BL/6小鼠肝组织的苏木精和伊红(H&E)染色、油红O染色和胶原纤维(Masson)染色情况进行观察,同时检测了小鼠的甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平。结果显示,高脂饮食组(high fat diet,HFD)小鼠的肝脏呈现明显的脂质积聚和典型的炎症及纤维化等肝损伤状态,同时小鼠肝组织TC、TG、AST和ALT水平也显著升高。然而,在芹菜素干预后,上述肝脏脂质积聚和损伤现象均得到明显缓解,同时肝组织TC、TG、AST和ALT水平也显著降低。以上结果说明,芹菜素能够缓解高脂饮食诱导的肝脏脂质积聚和损伤。(2)研究芹菜素激活自噬对高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠肝脏脂质积聚和损伤的影响,首先对C57BL/6小鼠肝脏中自噬小体的数量变化进行观察,同时检测了自噬标志性蛋白LC3和P62的表达情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏中自噬小体数量增加,LC3和P62的蛋白表达水平上升,自噬被抑制。然而,芹菜素的干预进一步提高了LC3的蛋白表达水平,降低了P62的蛋白表达水平,激活了高脂饮食抑制的肝细胞自噬。接下来,在添加自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)后检测了小鼠肝脏脂质积聚和损伤情况。结果显示,CQ处理逆转了芹菜素缓解肝脏脂质积聚和肝损伤的作用,导致小鼠肝组织脂滴数量增多,TC和TG水平升高。同时,H&E染色结果显示,小鼠肝组织出现大量炎性细胞浸润和少量细胞核皱缩等典型的肝损伤状态,并伴随AST和ALT水平升高。以上结果说明,芹菜素通过激活自噬缓解高脂饮食诱导的肝脏脂质积聚和损伤。(3)研究芹菜素激活自噬对PA处理的AML12细胞和Hep G2细胞脂质积聚和损伤的影响,首先对AML12细胞和Hep G2细胞中自噬小体的数量变化进行观察,同时检测了自噬标志性蛋白LC3和P62的表达情况。结果显示,PA处理后AML12细胞和Hep G2细胞中自噬小体数量增加,同时LC3和P62的蛋白表达水平上升。然而,芹菜素的干预进一步提高了LC3的蛋白表达水平,降低了P62的蛋白表达水平,从而激活了PA抑制的细胞自噬。接下来,在添加CQ后检测了AML12细胞和Hep G2细胞中的脂质积聚情况。结果显示,CQ处理逆转了芹菜素的降脂作用。通过油红O染色观察发现,CQ处理后的细胞内脂滴数量增多,TC和TG水平升高。以上结果说明,芹菜素通过激活自噬缓解PA诱导的肝细胞脂质积聚和损伤。(2)芹菜素缓解高脂饮食诱导肝细胞焦亡的作用及机制(1)研究芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞焦亡的作用,首先对C57BL/6小鼠和AML12细胞中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素18(interleukin-18,IL-18)的释放情况进行了考察,同时检测了NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(cleaved-caspase-1)、消皮素D的N端(GSDMD-N)、IL-1β、IL-18的蛋白表达情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏和PA处理的AML12细胞中LDH、IL-1β和IL-18的释放增加,焦亡标志性蛋白和m RNA的表达水平升高。然而,芹菜素干预后明显改善了上述异常指标,使LDH、IL-1β和IL-18的释放减少,焦亡标志性蛋白的表达水平降低。以上结果说明,芹菜素能够缓解高脂饮食诱导的肝细胞焦亡。(2)研究芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞焦亡的机制,首先考察了芹菜素对线粒体自噬-ROS-溶酶体膜通透化(lysosomal membrane permeabilization,LMP)通路的影响。接着,对C57BL/6小鼠和AML12细胞中线粒体自噬关键蛋白磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase1,PINK1)和帕金森相关蛋白(Parkinson’s disease gene 2,Parkin)、溶酶体关联膜蛋白1(lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1)和组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的蛋白表达水平以及总ROS和线粒体ROS(mitochondrial reactive oxygen species,mt ROS)的积累水平进行检测,同时观察了吖啶橙(AO)染色和溶酶体追踪器(Lyso Tracker Red)的染色情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏和PA组AML12细胞中PINK1、Parkin和LAMP1的蛋白表达水平下降,ROS、mt ROS和CTSB的释放增加,AO和Lyso Tracker Red荧光强度降低,而芹菜素干预后显著改善了上述异常变化。随后,在分别添加了LC3-si RNA、线粒体自噬抑制剂环孢霉素A(Cyclosporin A,Cs A)、ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸乙酯(N-Acetyl-L-cysteine ethyl ester,NAC)、CTSB抑制剂CA-074甲酯(CA-074methyl ester,CA-074 Me)和NLRP3抑制剂MCC950处理细胞后,对焦亡指标以及NLRP3蛋白和CTSB蛋白的共定位染色情况进行检测。结果显示,LC3-si RNA和Cs A在一定程度上削弱了芹菜素缓解肝细胞焦亡的作用,而NAC、CA-074 Me和MCC950则促进了芹菜素缓解肝细胞焦亡的作用。以上结果说明,芹菜素通过线粒体自噬-ROS-LMP通路缓解https://www.selleck.cn/products/dorsomorphin-2hcl.html高脂饮食诱导的肝细胞焦亡。(3)芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞铁死亡的作用及机制(1)研究芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞铁死亡的作用,首先对C57BL/6小鼠肝脏和AML12细胞中的Lillie染色情况以及线粒体变化进行了观察,同时检测了细胞内铁离子含量、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平以及铁死亡关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白重链(feEvolutionary biologyrritin heavy chain,FTH)、铁运蛋白(ferroportin,FPN)、长链脂酰辅酶A合成酶4(longchain acyl-coa synthetase 4,ACSL4)和转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,Tf R1)的表达情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏和PA组AML12细胞中MDA、ROS、铁离子含量以及ACSL4和Tf R1的蛋白表达水平升高,GSH含量以及GPX4、FTH和FPN的蛋白表达水平下降,而芹菜素的干预显著改善了上述异常指标。以上结果说明,芹菜素能够缓解高脂饮食诱导的肝细胞铁死亡。(2)研究芹菜素对高脂饮食诱导的肝细胞铁死亡的机制,在分别添加了LC3-si RNA、Cs A、NAC、铁离子螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)和溶酶体膜稳定剂氯化铵(NH_4Cl)处理细胞后,对铁死亡指标以及PINK1蛋白和FTH蛋白的共定位情况进行了检测。结果显示,LC3-si RNA和Cs A能够削弱芹菜素缓解肝细胞铁死亡的作用,而NAC、DFO和NH_4Cl则进一步促进了芹菜素缓解肝细胞铁死亡的作用。以上结果说明,芹菜素通过线粒体自噬-ROS-LMP通路缓解高脂饮食诱导的肝细胞铁死亡。综上所述,本论文阐述了芹菜素激活自噬缓解高脂饮食所致肝损伤的作用,具体机制为芹菜素通过激活线粒体自噬-ROS-LMP通路缓selleckchem Ipatasertib解高脂饮食诱导的肝细胞脂质积聚、焦亡和铁死亡,从而缓解了肝损伤。本论文的研究为芹菜素在肝脏保护方面提供了新的研究思路,对保障人体健康具有重要意义。