研究背景:抑郁症是一种发病率高,病症复杂的精神类疾病,在临床上主要症状是心情低落、此网站兴趣减低和睡眠质量差等,严重影响人们的身心健康。目前经典的抗抑郁药物如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)存在起效慢、疗效低、毒性大等多种局限性,因此研发安全、高效的新型抗抑郁药物是刻不容缓的任务。中药具有高效、低毒、整体调节等特点,在抑郁症的防治中发挥一定的优势。中药合欢皮(ALBIZIAE CORTEX)具有解郁安神、镇定的功效,是临床治疗抑郁症和焦虑症最常用的中药之一,但其抗抑郁或抗焦虑的分子作用机制尚不清楚。课题组前期从合欢皮的提取物中分离和鉴定了一种天然的木脂素糖苷类化合物(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(SAG),且SAG非竞争性地抑制三种单胺转运体的活性,表明其抑制5-羟色胺转运体(SERT)作用机制与传统抗抑郁药不同。基于此,本课题将进Critical Care Medicine一步解明SAG抑制SERT的新作用机制,并为新型抗抑郁药物分子的研发提供科学依据。研究内容:1.考察Barasertib IC50SAG对h SERT内向构象的影响。通过对第277位氨基酸进行定点突变,引入能够与2-氨乙基甲硫代磺酸盐氢溴酸盐(2-Aminoethyl methanethiosulfonate hydrobromide,MTSEA)发生反应的半胱氨酸(S277C),利用共聚焦显微镜观察内向构象的构象变化。本研究选择了S277C/X5Ch SERT表达载体,以研究SAG对h SERT内向构象的影响。2.构建人类多巴胺转运体和去甲肾上腺素转运体模型。根据果蝇多巴胺转运体的冷冻电镜结构(PDB ID 4XP1),利用同源建模软件MODELLER构建了人类多巴胺转运体和去甲肾上腺素转运体的同源模型。从产生的50个模型中,选取打分最高的模型进行后续工作。3.SAG与三种单胺转运体的分子对接。以h SERT结合维拉佐酮的冷冻电镜结构(PDB ID 7LWD)为参考对象,设置SAG的对接范围,利用Schr?dinger软件将SAG与三种人类单胺转运体的分子对接。4.免疫荧光实验验证SAG与单胺转运体的结合位点。基于以上的分子对接结果,对已被广泛报道的两种人类单胺转运体与底物结合的S1中心结合位点和三种单胺转运体S2变构结合位点上的氨基酸残基进行了单点突变并通过转运和结合实验验证SAG与单胺转运体的结合位点。研究结果:1.与单独孵育MTSEA相比,当加入底物5-HT时,荧光强度增强,而使用抗抑郁药物氟西汀处理,荧光强度减弱。结果表明,加入SAG可以显著减少S277C与MTSEA的反应,表明SAG能够稳定h SERT内向关闭的构象,结合本课题组前期的研究结果,证明SAG能够同时使得h SERT胞外和胞内通路关闭,使h SERT处于occluded的构象状态。2.在分子对接结果中,选取打分最高的复合体模型进行进一步的分析,发现在h SERT中,有15个氨基酸残基与SAG的结合相关;在h DAT中,有8个氨基酸残基与SAG的结合相关;在h NET中,有8个氨基酸残基与SAG的结合相关。3.通过免疫荧光实验发现,三种单胺转运蛋白S2突变体对SAG的抑制能力显著下降,但是S1突变体对SAG的抑制能力无显著影响,确定了SAG结合在三种单胺转运体的S2位点,且S1中心结合位点的突变不影响SAG的结合抑制能力。结论:SAG能够同时使得h SERT胞外和胞内通路关闭,即SAG使h SERT处于occluded的构象状态。分子对接结果表明,SAG与这三种人单胺转运体的S2变构位点结合。免疫荧光实验结果与分子对接结果一致,证实SAG与S2变构结合位点结合,且SAG抑制三种单胺转运体的能力不受S1中心结合位点的氨基酸残基突变的影响。综上所述,SAG通过结合在三种单胺转运体的S2变构结合位点,抑制三种单胺转运体的转运活性,发挥抗抑郁的作用。