川佛手来源于芸香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle,以未成熟果实纵切薄片干燥后入药。Wound infection佛手饮片宽端呈指状分裂,边缘表皮绿褐色或黄褐色,以片张完整、青皮白肉、气清香者为优。其药材性状特征与佛手鲜果的生长状态直接相关。本课题组在中药资源普查过程中发现部分佛手树上的果实形态不一,除常见的顶端指状结构闭合如拳、整体呈长圆形的正常果外,还有与柑橘形态相似、呈扁圆形的异形果。本研究首先对两种果实的外观品质进行评价,并通过转录组测序和基因家族分析,筛选调控异形果形成的关键基因,进一步借助酿酒酵母遗传转化体系、烟草瞬时表达体系与拟南芥遗传转化体系,对关键基因进行功能验证,初步揭示异形果形成的分子机制。本研究的主要结果如下:1)比较川佛手正常果与异形果的表观品质,包括果实大小、果皮色泽及色素含量。佛手正常果长圆形,有指状裂瓣,果形指数均大于1.2;异形果呈扁平状,果形指数在0.4-0.6。异形果的亮度值L*、偏黄值b*均高于正常果,偏绿值a*低于正常果。进一步测定表皮色素含量,异形果的总叶绿素与类胡萝卜素含量均低于正常果,但类胡萝卜素与总叶绿素含量的比值显著高于正常果。2)筛选调控异形果形成的关键基因。对川佛手正常果与异形果进行转录组分析,7个ABC转运蛋白家族基因在异形果中的基因表达量均低于正常果。在佛手中鉴定到119个ABC转运蛋白家族成员,筛选获得关键转运蛋白基因CmABCB19 与 CmABCC10。克隆到 CmABCB19 与 CmABCC10 基因全长 cDNA序列,并与已知功能的ABC转运蛋白进行序列相似度和保守结构域比对,推测CmABCB19转运蛋白可转运生长素IAA,CmABCC10转运蛋白可转运类黄酮成分。3)测定川佛手正常果和异形果中生长素及类黄酮成分含量。利用UPLC-3Q-MS测定川佛手生长素含量,结果表明佛手正常果中生长素IAA及IBA含量均高于异形果。利用UPLC-Q-TOF-MS对川佛手的类黄酮成分进行IACS-010759测定,通过OPLS-DA分析获得5种异形果和正常果的差异类黄酮成分,其中异形果中柚皮苷、香叶木苷和川陈皮素含量高于正常果,芦丁和橙皮素含量低于正常果。4)利用酿酒酵母遗传转化体系对转运蛋白进行功能分析。利用酿酒酵母野生型、突变株及互补突变株株系,在添加不同底物的培养基中进行孵育,在固定时间点测定酵母菌体中积累底物含量,进而推测CmABCB19蛋白在酵母细胞中具有生长素转出作用;CmABCC10蛋白在酵母细胞中具有介导柚皮苷、川陈皮素及香叶木苷转出,芦丁和橙皮素的转入作用。5)利用烟草瞬时转化体系对转运蛋白进行亚细胞定位分析,融合荧光蛋白显示,CmABCB19在细胞膜上表达,CmABCC10在液泡膜上表达。利用拟南芥遗传转化体系进行转运蛋白功能分析,与拟南芥突变株abcb19相比,abcb19-CmABCB19互补突变株中生长素生物合成与信号转导相关基因表达水平显著上调,生长素含量升高,同时芦丁和柚皮苷含量也升高,说明佛手CmABCB19可参与生长素转运积累,同时间接调控类黄酮成分的合成。与拟南芥突变株abcc10相比,abcc10-CmABCC10互补突变株中类黄酮合成相关基因表达水平显著上调,芦丁和柚皮苷含量升高,同时生长素含量也升高,说明CmABCC10可参与类黄酮成分的转运积累,同时对生长素的合成转运也有调控作用。同时,拟南芥中转运蛋ICI 46474体外白CmABCB19与CmABCC10对角果和种子发育也有影响。综上所述,推测在生长过程中佛手异形果ABC转运蛋白的表达水平受到抑制,导致果实中生长素及类黄酮成分含量减少,进而引发果实表观性状及内在品质特征改变。