以重要免疫分子为靶标,通过抗体或抑制剂等阻断相关信号通路、调控免疫细胞功能,是目前疾病免疫治疗的重要手段,广泛应用于肿瘤、自身免疫病等多种免疫相关疾病,并取得良好效果。然而免疫反应具有两面性,不足或过度的免疫应答均会损坏免疫稳态并导致相关疾病。如何动态调控免疫反应、适时适量调控免疫应答是免疫治疗亟需解决的重要问题。免疫抑制性受体T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,Tim-3)广泛表达于NK细胞、T细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞表面,并调控上述细胞功能,参与炎症、慢性病毒感染和肿瘤等多种疾病进展。临床前研究表明干预Tim-3影响多种疾病进程,是免疫治疗的潜在靶点。本实验室前期研究发现,在肝癌组织中Tim-3高表达于NK细胞,与其配体磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)结合后,抑制AKT-mTOR通路介导NK细胞功能耗竭。PS作为小分子脂类物质,易于合成与修饰。是否可以对PS进行修饰作为Tim-3通路的调控开关,进而调控免疫细胞功能,成为疾病免疫干预的新策略,是本论文的研究目的。为此,我们与药学院课题组合作,设计合成了在结构上模拟PS的小分子探针-光敏磷脂酰丝氨酸(Photophosphatidylserine,phoPS)。phoPS在365 nm光照下呈现与天然PS 一致的顺式构象(cis-phoPS),与Tim-3有较高的结合能力;而455 nm光照下phoPS呈现反式构象(trans-phoPS),不能与Tim-3结合。本论文旨在以phoPS为工具,通过光照调控NK细胞和T细胞功能,并探讨其在免疫相关疾病中的作用,为光控免疫治疗提供新策略。主要研究方法与结果如下:第一部分 光控磷酯酰丝氨酸以Tim-3依赖的方式调控NK细胞功能为了确定PS对NK细胞的调节作用,我们首先利用脂质体包裹商品化PS,体外处理活化的人NK92细胞系和小鼠原代NK细胞。流式检测结果显示,PS显著抑制不同来源NK细胞的细胞因子分泌及细胞杀伤能力。进一步利用Tim-3敲除(Tim-3-/-)鼠的原代NK细胞重复上述实验,发现PS不能抑制Tim-3-/-小鼠NK细胞功能。上述结果证明了 PS作为配体参与Tim-3介导的NK细胞功能调控。为研究phoPS对NK细胞的调控作用,我们首先检测光照处理和phoPS是否影响NK细胞活性。CellTiter-LumiTM法等细胞活性检测结果显示,365 nm和455 nm的光辐照处理不影响NK细胞活性,而且20μg/mL及以下Laduviglusib小鼠浓度的phoPS对NK细胞和靶细胞均没有细胞毒性。因此,在后续细胞实验中我们使用20 μg/mL phoPS联合365 nm和455 nm光辐照的方式处理细胞。在NK92细胞中加入20 μg/mL phoPS后,分别进行单次365 nm、455 nm波长光辐照或365 nm-455 nm依次辐照,单次辐照时间为5 min。流式结果表明,与天然PS相类似,365 nm辐照后的cis-phoPS可以bacterial infection显著抑制NK细胞分泌细胞因子能力及杀伤活性,而trans-phoPS(不辐照处理或进行455 nm辐照)并不影响NK细胞的功能。进一步实验发现cis-phoPS不能调控Tim-3-/-小鼠来源NK细胞功能。上述结果证明,特定波长光照phoPS以Tim-3依赖性的方式调控NK细胞功能。为明确光照是否可以通过改变phoPS构象动态调节NK细胞的功能,分别用转换波长光在不同时间多次辐照phoPS处理的NK92细胞。流式检测结果显示,365 nm紫外光激活的cis-phoPS抑制NK细胞功能,这一作用可以被455nm蓝光光照关闭(NK细胞功能不再被调控);而455 nm处理的trans-phoPS在365 nm光照后可以重新抑制NK细胞功能。上述结果表明,通过phoPS可以实现动态光控调节NK细胞的功能。为了进一步验证phoPS是否可以体内光控NK细胞功能,构建poly(I:C)诱导的小鼠急性肝炎模型,并对小鼠灌胃phoPS治疗,随后每隔12 h对小鼠腹腔进行365 nm或455 nm光辐照治疗(每次光照持续时间为10 min),36 h后处死小鼠检测相关指标。血清及病理检查结果表明,phoPS灌胃辅以365 nm光照治疗能有效缓解poly(I:C)诱导的小鼠急性肝炎,而phoPS灌胃结合455 nm光照则不影响poly(I:C)诱导的小鼠急性肝炎进展。第二部分光控磷酯酰丝氨酸以Tim-3依赖的方式调控T细胞功能Tim-3选择性表达于活化的CD8+T细胞和Th1细胞,抑制IFN-γ表达,参与CD8+T细胞功能耗竭。然而作为Tim-3配体,PS是否介导Th1和CD8+T细胞功能障碍尚未见报道。为明确PS是否以Tim-3依赖方式调节T细胞功能,利用OT-Ⅰ和OT-Ⅱ TCR转基因小鼠,分别诱导活化CD8+细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)和Th1细胞。细胞因子分泌功能和细胞杀伤实验结果表明,PS不仅明显抑制CTL的细胞因子分泌能力和杀伤功能,还抑制Th1细胞分泌IFN-γ的能力。然而,Tim-3中和抗体预处理显著破坏PS介导的T细胞抑制作用。同样,PS不能影响Tim-3敲除CD8+CTL的功能。RNA-seq分析联合Western blotting验证显示,PS处理显著抑制T细胞TCR和mTOR信号通路。综上,PS以Tim-3依赖性方式抑制CD8+T细胞和Th1细胞功selleckchem Belumosudil能。为明确phoPS是否能介导光控调节T细胞功能,分别用不同波长光辐照phoPS处理OT-Ⅰ来源的CTL(单次辐照时间5 min)。与NK细胞中的结果一致,phoPS仅在365 nm单次辐照或者最后为365 nm的多次循环光辐照后抑制CTL的效应功能;而455 nm单次辐照或最后为455 nm的多次循环光辐照均不能影响CTL的功能,即借助phoPS可以光控调节T细胞功能。为进一步确定phoPS的体内调控作用,小鼠灌胃phoPS24h后,尾静脉注射刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠急性肝炎;同时对小鼠腹腔部位进行转换波长光辐照,8 h后检测小鼠各项指标。肝功能检测、RT-qPCR及H&E染色结果显示,与灌胃天然PS治疗效果相同,phoPS结合365 nm辐照明显缓解ConA诱导的小鼠急性肝炎进展,表现为血清AST上升幅度变缓、肝脏炎性因子表达显著下调、肝脏炎性病灶面积减小。结论及意义:本研究证实利用光敏探针phoPS可以在365 nm/455 nm光照下以Tim-3依赖的方式动态调节NK细胞和T细胞功能,首次在体内外实现了动态可控的免疫调节,为可控免疫治疗提出了新策略。