研究背景:结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的传染病。天然免疫是宿主抵抗外界病原体感染的第一道免疫防线,巨噬细胞(macrophage,Mφ)具有强大的杀菌作用,其作为天然免疫的重要因素,在抗结核免疫中发挥举足轻重的作用。MTB可引起Mφ的多种死亡途径来实现免疫逃逸,其中包括坏死性凋亡(necroptosis)、铁死亡(ferroptosis)、焦亡(pyroptosis)等。因此,发掘能够对抗MTB感染所诱导的细胞死亡的药物将对于结核病患者的临床治疗具有重要意义。同时,鉴于耐药性结核病的不断出现,抗生素在治疗结核病方面面临着重大的挑战,寻找新型抗结核药物极具科学与现实意义。目前新药研发难度相对较大,因此老药新用的思路为药物研发提供了重要的手段。本课题从已上市批准以及药典收录的原料药物库FDA(Food and Drug Administration)药物库中筛选和挖掘具有抗结核作用的药物具有临床意义。研究目的与方法:1、RNA测序结合免疫印迹实验(Western blot)验证MTB感染引起的细胞死亡方式;2、利用CCK-8法检测细胞活力初步筛选FDA药物库中MDV3100 IC50对MTB感染Mφ起保护性作用的小分子药物;3、扫描电镜、透射电镜观察MTB感染小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)在顺苯磺酸阿曲库铵(Cisatracurium besylate,CIS)处理前后坏死细胞形态变化;4、免疫组化检测结核患者和慢性炎症病人肺组织坏死性凋亡相关selleckchem NN2211分子人混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)磷酸化水平;5、Western blot、CCK-8检测MTB感染BMDM使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1或激动剂RES与CIS同时处理细胞后坏死性凋亡相关分子磷酸化水平变化;6、免疫荧光技术检测MTB感染的BMDM在CIS处理前后MLKL易位情况;7、TNF-α+zVAD刺激L929细胞系建立经典坏死性凋亡细胞模型,Western blot、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测坏死性凋亡相关分子MLKL磷酸化水平及表达变化;8、药物亲和反应的靶点稳定性实验(DARTS)及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验验证CIS作用靶点及CIS处理前后坏死性凋亡相关分子间相互作用;9、分别构建MLKL、受体相互作用蛋白丝/苏氨酸激酶3(Receptor-interacting protein kinases 3,RIPK3)结构域质粒,DARTS及Co-IP实验验证CIS作用的蛋白分子具体结构域;10、沉默 RIPK3 上游分子 Z-DNA 结合蛋白(Z-DNA binding protein 1,ZBP1)、受体相互作用蛋白丝/苏氨酸激酶 1(Receptor-interacting protein kinases 1,RIPK1)、Toll 受体相关的干扰素激活蛋白(TIR domain-containing adapter-inducing interferon,TRIF),Western blot、CCK-8检测沉默相关基因后下游磷酸化水平变化,确定MTB感染Mφ启动坏死性凋亡的上游分子;11、在体内和体外分别构建CIS治疗MTB感染细胞模型、动物模型,检测CIS单独和(或)异烟肼联合用药后巨噬细胞杀菌效应;12、免疫组化、HE染色检测小鼠体内实验模型中肺组织p-MLKL水平及炎症浸润情况。研究结果:1、MTB感染可诱导Mφ发生不同类型细胞死亡;2、CIS抑制MTB感染Mφ导致的坏死性凋亡;3、CIS通过抑制RIPK3和MLKL之间的相互作用来抑制MLKL磷酸化;4、CIS抑制MTB感染Mφ的RIPK1/RIPK3和ZBP1/RIPK3坏死性凋亡信号通路,但不通过RIPK1或ZBP1和RIPK3之间的相互作用发挥作用;5、CIS在genetic parameter体外和体内对抗MTB感染均发挥保护作用。结论:本研究中,我们从FDA批准的药物库中筛选出CIS,研究显示在Mφ感染MTB时CIS对宿主表现出高度的保护性作用。我们首先通过转录组学测序同时结合死亡方式特征性蛋白表达检测、MTB感染前后Mφ形态学改变,证明CIS能够抑制MTB感染引起的坏死性凋亡,但对感染引起的其他死亡方式无影响。机制上,本研究发现CIS通过抑制坏死性凋亡相关分子RIPK3和标志性分子MLKL结合形成坏死性凋亡小体,从而阻止MLKL在胞膜上磷酸化和打孔,且CIS不影响MTB感染过程中RIPK3与上游分子RIPK1、ZBP1的结合。体内研究实验证明CIS在小鼠体内能够显著抑制胞内MTB的增殖,同时对于辅助一线抗结核药物异烟肼、利福平等的临床应用具有一定前景。