目的:本研究通过建立db/db小鼠模型及高糖处理的HT22细胞模型,观察益糖康对db/db小鼠行为学功能和神经元及突触损伤,并且观察了益糖康对db/db小鼠模型和高糖诱导的HT22细胞中铁代谢、氧化应激/脂质过氧化以及铁死亡的影响,旨在讨论益糖康对T2DM认知障碍以及海马神经元铁死亡的改善作用以及相关机制,为益糖康的临床应用提供一定理论依据。材料与方法:论文一:益糖康对db/db小鼠认知障碍的改善以及海马神经元和突触可塑性损伤的修复SPF级雄性db/db小鼠30只,随机分为3组:模型组(db/db组)、西药(西药选用利拉鲁肽Liraglutide)对照组(LIRA组)、益糖康组(YTK组);10只db/m小鼠作为空白对照组(db/m组)。饲养至第10周时进行造模,YTK组小鼠予以益MEK抑制剂糖康煎剂灌胃30g·kg~(-1)·d~(-1),LIRA组每日腹腔注射利拉鲁肽200μg·kg~(-1),db/m组和db/db组小鼠给予与每日灌胃益MLN4924糖康煎剂同体积蒸馏水,造模时间共5周。首先对小鼠空腹血糖进行检测;通过葡萄糖耐量、胰岛素耐量、丙酮酸耐量实验观察小鼠糖代谢、胰岛素储备以及肝糖异生能力;生化分析检测各组小鼠血清TG、TC及LDL-C水平;ELISA检测各组小鼠血清INS及Hb A1C水平;Morris水迷宫、Y迷宫和旷场实验对小鼠进行行为学检测;透射电镜观察神经元突触完整性;FJC染色、Nissl染色观察神经元状态;免疫荧光检测海马Neu N、MAP2的表达;Western blot检测海马PSD95、SYN及BDNF等突触相关蛋白表达。通过以上实验验证益糖康是否可以改善db/db小鼠认知障碍以及神经元和突触可塑性损伤。论文二:益糖康对db/db小鼠海马神经元铁死亡改善研究实验动物分组、给药方法同论文一。通过Cox1和Cox4的免疫双标染色检测海马神经元线粒体功能;透射电镜观察海马神经元线粒体结构;生化及ELISA检测血清和海马组织中GSH水平及GSH-Px活性;Western blot及免疫荧光检测海马神经元铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11及ACSL4表达;q-PCR检测GPX4及SLC7A11 m RNA表达。通过以上实验验证益糖康是否可以抑制db/db小鼠海马神经元铁死亡。论文三:益糖康对db/db小鼠海马神经元铁超载和氧化应激改善的机制研究实验动物分组、给药方法同论文一。生化分析检测血清和海马组织中SOD、CAT及MDA水平;DHE染色检测海马ROS含量;Western blot检测海马NOX2、NOX4及SOD2表达;Western blot及免疫组化检测海马4-HNE表达;血清铁及组织铁试剂盒检测血清及海马组织中铁含量;普鲁士蓝染色观察海马组织CA1、CA3及DG区中铁的分布;Western blot检测海马中铁储存蛋白FTL、FTH,铁转运相关蛋白Tf R1、DMT1、FPN1,线粒体铁储存蛋白Mtft及线粒体铁转运蛋白Mfrn2的表达;q-PCR检测Tf R1及FPN1 m RNA表达。通过以上实验验证益糖康对db/db小鼠脑内铁超载以及氧化应激的作用以及相关机制。论文四:益糖康抑制高糖诱导的HT22海马神经元细胞铁超载、氧化应激及铁死亡的机制研究将HT22海马神经元细胞予以高糖(50m M)处理48h建立高糖模型,同时制备益糖康含药血清。细胞实验共设置三部分分组:(1)第一部分设置四组:正常对照(Con)组:25m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清处理48h;高糖(HG)组:50m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清处理48h;铁死亡抑制剂(Fer-1)组:50m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清+10μM Fer-1处理48h;益糖康(YTK)组:50m M葡萄糖培养基+5%大鼠含药血清处理48h。通过JC-1染色和透射电镜观察细胞线粒体功能和结构;通过C11 BODIPY 581/591染色、western blot及免疫荧光染色观察HT22细胞脂质过氧化和PSD95、ACSL4、GPX4和SLC7A11蛋白表达。本部分主要探究高糖是否诱导了神经元铁死亡,以及益糖康含药血清是否可以抑制铁死亡的发生。(2)第二部分设置五组:正常对照(Con)组:25m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清处理48h;高糖(HG)组:50m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清处理48h;铁螯合剂(DFO)组:50m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清+100μM DFO处理48h;抗氧化剂(NAC)组:2m M NAC预处理4h后,50m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清处理48h;益糖康(YTK)组:50m M葡萄糖培养基+5%大鼠含药血清处理48h。通过JC-1染色和透射电镜观察细胞线粒体功能和结构;通过DCFH-DA染色、C11 BODIPY 581/591染色以及western blot观察细胞氧化应激、脂质过氧化水平以及SOD2表达;通过钙黄绿素染色以及Ferro Orange染色观察HT22细胞Fe~(2+)水平;western blot检测铁相关蛋白FTL、FTH、Tf R1、FPN1及Mfrn2蛋白表达。本部分主要探究高糖是否通过相关调控通路诱导了铁超载和氧化应激,进而引发神经元铁死亡,而益糖康含药血清是否可以降低铁超载和氧化应激,从而抑制铁死亡的发生。(3)第三部分设置四组:正常对照(Con)组:25m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清处理24h;铁死亡激动剂(RSL3)组:25m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清+0.25μM RSL3处理24h;铁死亡抑制剂(RSL3+Fer-1)组:25m M葡萄糖培养基+5%正常大鼠血清+0.25μM RSL3+10μM Fer-1处理24h;益糖康处理组(RSL3+YTK)组:25m M葡萄糖培养基+0.25μM RSL3+5%含药大鼠血清处理24h。通过透射电镜观察细胞线粒体结构;通过C11 BODIPY 581/591染色观察细胞脂质过氧化;western blot及免疫荧光染色观察ACSL4、GPX4和SLC7A11蛋白表达。本部分主要探究益糖康是否可以改善RSL3诱导的铁死亡,以表明其对GPX4表达和铁死亡是否有直接作用。结果:论文一:益糖康对db/db小鼠认知障碍的改善以及海马神经元和突触可塑性损伤的修复1.益糖康对糖脂水平以及胰岛素抵抗的改善:与db/m组相比,db/db组空腹血糖值显著升高(P<0.05),三种耐量实验的AUC均显著增加(P<0.05),血清INS及Hb A1C水平明显升高(P<0.05),TG、TC及LDL-C水平显著升高(P<0.05);与db/db组相比,LIRA组与YTK组血糖显著下降(P<0.05),葡萄糖耐量与胰岛素耐量AUC显著减少(P<0.05),INS及Hb A1C有明显改善(P<0.05),TG、TC及LDL-C水平显著降低(P<0.05)。结果表明,益糖康可以显著降低db/db小鼠糖脂水平异常,改善胰岛素抵抗。2.益糖康对行为学水平的改善:与db/m组相比,db/db小鼠水迷宫实验中在1-5天内逃逸潜伏时间均显著增加(P<0.05),第五天逃逸路程增加,2min内穿越圆台位置次数显著减少(P<0.05),Y迷宫实验中在新异臂探索的时间百分比均降低(P<0.05),旷场实验中在中心区域活动的路程及时间与总路程和时间的百分比均减少(P<0.05);与db/db组相比,LIRA组与YTK组小鼠水迷宫实验中逃逸时间均下降(P<0.05),第五天逃逸路程缩短,穿越圆台位置次数增加(P<0.05),Y迷宫实验中在新异臂探索时间百分比上升(P<0.05),而旷场实验中YTK组小鼠的中心区域路程比及时间比均显著增加(P<0.05),但LIRA组相较db/db组差异并无明显统计学意义。结果表明,益糖康可以显著提高db/db小鼠的学习记忆功能,缓解焦虑状态,改善认知功能障碍。3.益糖康对海马神经元和突触可塑性的改善:与db/m组相比,db/db小鼠海马组织中FJC阳性细胞数量显著增加(P<0.05),海马CA1、CA3区以及齿状回(Dentate gyrus,DG)的尼氏染色变浅,尼氏小体数量减少(P<0.05),Neu N和MAP2阳性区域显著降低(P<0.05),PSD95、SYN和BDNF表达显著降低(P<0.05),突触间隙宽度增加,突触间致密物质减少;与db/db组相比,LIRA组与YTK组小鼠FJC阳性细胞的数量显著减少(P<0.05),海马各区域尼氏小体数量增多(P<0.05),MAP2与Neu N阳性表达显著增加(P<0.05),PSD95、SYN和BDNF表达显著提升(P<0.05),海马神经元的突触损伤显著改善。结果表明,益糖康可以修复db/db小鼠海马神经元及突触可塑性损伤,改善神经元及突触相关功能蛋白表达。论文二:益糖康对db/db小鼠海马神经元铁死亡改善研究1.益糖康对海马神经元线粒体功能的改善:与db/m组相比,db/db组小鼠Cox1荧光表达减弱(P<0.05),Cox4荧光表达增加(P<0.05),线粒体萎缩、线粒体膜变厚、线粒体嵴减少,部分线粒体膜出现破裂情况;与db/db组相比,LIRA组和YTK组Cox1表达上升(P<0.05),Cox4表达下调(P<0.05),线粒体结构改善,线粒体大小恢复,线粒体嵴增加。结果提示益糖康可以改善db/db小鼠海马神经元线粒体功能结构损伤,改善神经元出现的铁死亡病理形态。2.海马GSH水平及GSH-Px活性的改善:与db/m组相比,db/db小鼠GSH水平及GSH-Px活性显著降低(P<0.05);与db/db组相fetal head biometry比,LIRA组和YTK组GSH及GSH-Px有明显改善(P<0.05)。结果表明,益糖康可有效提升db/db小鼠GSH水平和GSH-Px活性。3.益糖康对海马神经元铁死亡相关调控蛋白表达的调控:与db/m组相比,db/db组小鼠海马GPX4及SLC7A11蛋白表达明显降低(P<0.05),而ACSL4蛋白表达显著升高(P<0.05);与db/db组相比,LIRA组和YTK组GPX4及SLC7A11表达上调(P<0.05),ACSL4表达下调(P<0.05)。结果表明,益糖康可以调节db/db小鼠海马内铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11及ACSL4表达。论文三:益糖康对db/db小鼠海马神经元铁超载和氧化应激改善的机制研究1.益糖康对海马神经元氧化应激的改善:与db/m组相比,db/db组小鼠血清和海马组织中SOD含量显著降低(P<0.05),DHE染色中ROS水平显着增加(P<0.05),海马NOX2、NOX4表达显着增加,SOD2表达降低(P<0.05);与db/db组相比,LIRA组和YTK组SOD水平上升(P<0.05),ROS水平显着降低(P<0.05),海马NOX2、NOX4表达降低,SOD2表达上调(P<0.05)。结果提示,益糖康可以改善db/db小鼠海马氧化应激。2.益糖康对海马神经元脂质过氧化的改善:与db/m组相比,db/db组小鼠血清和海马组织中MDA水平升高(P<0.05),4-HNE表达显著增加(P<0.05);与db/db组相比,LIRA组和YTK组MDA水平下降(P<0.05),海马4-HNE蛋白表达降低(P<0.05)。结果提示,益糖康可以降低db/db小鼠海马脂质过氧化物积累,降低脂质过氧化。3.益糖康对海马铁超载的改善:与db/m组相比,db/db组小鼠血清及海马组织中铁含量均明显升高(P<0.05),海马组织CA1、CA3及DG区Fe阳性区域面积均明显增加(P<0.05);与db/db组相比,LIRA组和YTK组小鼠血清和海马组织铁含量较db/db组显著降低(P<0.05),海马组织CA1、CA3及DG区Fe阳性区域面积均降低(P<0.05)。结果提示,益糖康可以有效降低db/db小鼠海马铁超载。4.益糖康对海马铁相关蛋白的调控:与db/m组比较,db/db小鼠海马铁储存蛋白FTH表达下降(P<0.05),铁相关转运蛋白Tf R1、DMT1表达显著升高(P<0.05),FPN1表达降低(P<0.05),Tf R1 m RNA表达明显升高,FPN1 m RNA表达降低(P<0.05),线粒体铁储存蛋白Mtft表达下降(P<0.05),线粒体铁转运蛋白Mfrn2表达显著升高(P<0.05);与db/db组比较,LIRA组和YTK组小鼠海马FTH表达升高(P<0.05),Tf R1、DMT1表达降低(P<0.05),FPN1表达显著升高(P<0.05),海马Tf R1 m RNA表达下降,FPN1 m RNA上升(P<0.05)Mtft表达升高(P<0.05),Mfrn2表达降低(P<0.05)。结果提示,益糖康可以上调海马铁储存蛋白FTH表达,下调铁转入蛋白Tf R1与DMT1表达,上调铁转出蛋白FPN1表达,同时上调海马线粒体铁储存蛋白Mtft表达,下调线粒体铁转运蛋白Mfrn2表达。论文四:益糖康抑制高糖诱导的HT22海马神经元细胞铁超载、氧化应激及铁死亡的机制研究1.益糖康对高糖诱导的HT22细胞铁死亡的改善:与Con组比较,HG组细胞JC-1 Aggregation/JC-1 Monomer比值明显下降(P<0.05),线粒体结构出现皱缩、线粒体膜增厚,C11 BODIPY 581/591氧化态/还原态比值显著升高(P<0.05),同时ACSL4表达上调,PSD95、GPX4和SLC7A11蛋白表达下调(P<0.05);与HG组比较,Fer-1组和YTK组细胞JC-1 Aggregation/JC-1 Monomer比值显著提高(P<0.05),细胞线粒体结构改善,线粒体大小恢复,BODIPY 581/591氧化态/还原态比值降低(P<0.05),ACSL4表达减弱,PSD95、GPX4和SLC7A11蛋白表达上升(P<0.05)。结果提示,益糖康可以改善高糖诱导的HT22细胞铁死亡。2.益糖康对高糖诱导的HT22细胞氧化应激和脂质过氧化的改善:与Con组比较,HG组细胞ROS水平以及BODIPY 581/591氧化态/还原态比值水平显著升高(P<0.05),SOD2蛋白表达降低(P<0.05);与HG组比较,DFO组、NAC组和YTK组细胞ROS水平以及BODIPY 581/591氧化态/还原态比值水平降低(P<0.05),SOD2蛋白表达升高(P<0.05)。结果提示,益糖康可以降低高糖诱导的HT22细胞氧化应激和脂质过氧化水平。3.益糖康对高糖诱导的HT22细胞铁超载的改善及相关蛋白的调控:与Con组相比,HG组细胞钙黄绿素与Ferro Orange染色阳性区域面积均明显增加,Fe~(2+)水平升高(P<0.05),Tf R1、Mfrn2表达显著升高,FTH、FPN1表达显著降低(P<0.05);与HG组比较,DFO组和YTK组细胞两种染色阳性区域面积显著降低,Fe~(2+)水平显著降低(P<0.05),YTK组细胞Tf R1、Mfrn2表达显著下调,FTH和FPN1表达显著上调(P<0.05)。结果提示,益糖康可以通过上调铁储存蛋白FTH表达,下调胞质和线粒体铁转入蛋白Tf R1与Mfrn2表达,上调铁转出蛋白FPN1表达,从而显著降低高糖诱导的HT22铁超载。4.益糖康对RSL3诱导的HT22铁死亡的作用:与Con组比较,RSL3组细胞线粒体结构出现皱缩、线粒体膜增厚,部分线粒体破裂,出现铁死亡典型表现,C11BODIPY 581/591氧化态/还原态比值显著升高(P<0.05),脂质过氧化水平加重,同时ACSL4表达上调,GPX4和SLC7A11蛋白表达下调(P<0.05);与RSL3组比较,Fer-1组细胞线粒体结构改善,线粒体大小恢复,细胞BODIPY 581/591氧化态/还原态比值降低(P<0.05),ACSL4表达减弱,GPX4和SLC7A11蛋白表达上升(P<0.05);YTK组线粒体虽有部分恢复,但相对正常线粒体大小仍有差距,少部分线粒体破裂未得到改善,虽然BODIPY 581/591氧化态/还原态比值降低(P<0.05),GPX4蛋白表达升高(P<0.05),但较Con组与Fer-1组仍有差距,且ACSL4与SLC7A11蛋白表达无显著差异性改变。结果说明,益糖康对RSL3诱导的GPX4低表达和铁死亡调控有限。结论:1.益糖康可以改善T2DM导致的认知障碍,修复神经元和突触可塑性损伤。2.益糖康可以修复线粒体结构和功能损伤,上调GPX4和SLC7A11蛋白表达,下调ACSL4蛋白表达,改善T2DM诱导的海马神经元铁死亡。3.益糖康可能通过上调铁储存蛋白FTH表达,下调铁转入蛋白Tf R1与DMT1表达,上调铁转出蛋白FPN1表达,同时上调海马线粒体铁储存蛋白Mtft表达,下调线粒体铁转运蛋白Mfrn2表达,改善T2DM诱导的海马神经元铁超载。4.益糖康可能通过降低ROS和脂质氧化物水平,提高抗氧化物活性从而改善T2DM诱导的海马神经元氧化应激和脂质过氧化。5.益糖康可能通过调控铁代谢相关蛋白缓解铁超载,减弱氧化应激和脂质过氧化,从而改善T2DM诱导的海马神经元铁死亡,恢复认知功能。