目的:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要致病菌,具有外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)等多种毒力因子。由于囊泡膜结构的保护,P.gingivalis OMVs可以避免被降解并实现长距离传递,比细菌具有更强的毒性。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡,在炎症性疾病的发生发展中起着至关重要的作用。近年来的研究表明,P.gingivalis与肠道系统疾病密切相关,但关于其OMVs诱导铁死亡并加重肠道炎症的报道较少。在本实验中,我们研究了P.gingivalis OMVs对肠上皮细胞炎症反应的影响,并探索铁死亡在肠上皮炎症中的致病作用及机理,为牙周炎与肠道炎症性疾病之间的关系提供新的依据,为肠道系统疾病的防治提供新思路。材料与方法:1、用超高速离心法结合超滤法提取P.gingivalis W83的OMVs,并测定其浓度,再用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和纳米粒径追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)对其进行鉴定。2、P.gingivalis OMVs(10μg/m L)刺激人直肠腺癌细胞(Caco-2)12 h后用TEM观察其线粒体的形态变化。3、用quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)检测P.gingivalis OMVs刺激Caco-2细胞0 h、6 h和12 h后,白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平。4、P.gingivalis OMVs刺激Caco-2细胞0 h、6 h和12 h后,selleck激酶抑制剂用微量酶标法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量,使用亚铁嗪微板法检测Fe~(2+)的含量,用硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,用微板法检测还原型谷胱Adavosertib分子式甘肽(glutathione,GSH)的含量。5、P.gingivalis OMVs刺激Caco-2细胞0 h、6 h和12 h后,用qRT-PCR、Western blot或免疫荧光检测储铁蛋白重链(ferritin heavy,FTH)、氧化型低密度脂蛋白受体1(oxidized low-density lipoprotein receptor 1,LOX-1)和铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis-suppressor-protein 1,FSP1)的mRNA或蛋白表达。6、使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(1μmol/L)预处理12 h后,观察P.gingivalis OMVs刺激的Caco-2细胞线粒体形态的变化,检测IL-6、TNF-α、IL-18、IL-1β、FTH、LOX-1和FSP1的mRNA或蛋白表达水平以及Fe~(2+)、MDA和GSH的含量。7、本实验结果采用SPSS Statistics 25进行统计学分析,P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1、超高速离心法结合超滤法成功从P.gingivalis W83培养液中提取OMVs。2、TEM结果显示P.gingivalis OMVs诱导下的Caco-2细胞线粒体变小,膜密度增高,嵴数量减少。3、10μg/m L的P.gingivalis OMVs刺激Caco-2细胞6 h和12 h后,炎症因子IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平升高(P<0.05)。4、细胞毒性分析结果显示,P.gingivalis OMVs刺激Caco-2细胞后,LDH含量显著增高,细胞损伤及死亡数量增加(P<0.05)。5、qRT-PCR及微板法结果显示,P.gingivalis OMVs刺激使Caco-2细胞的FTH mRNA的表达水平升高,MDA和Fe~(2+)含量升高,GSH含量降低(P<0.05)。6、在P.gingivalis OMVs刺激下,LOX-1的mRNA表达水平升高,FSP1的mRNA及蛋白表达下降,而LOXPredictive medicine-1的Western blot及免疫荧光结果均显示其蛋白表达水平下降(P<0.05)。7、在Liproxstatin-1的作用下,P.gingivalis OMVs刺激的Caco-2细胞线粒体形态改善,IL-6、TNF-α、IL-18、IL-1β和FTH mRNA的表达水平降低,LDH、MDA和Fe~(2+)含量降低,GSH含量增高,LOX-1的mRNA表达水平下降而蛋白水平上升,FSP1的mRNA及蛋白表达水平均上升(P<0.05)。结论:P.gingivalis OMVs通过诱导铁死亡而加重肠上皮细胞炎症反应。