动物组织肥大细胞中形成的肝素是一种具有复杂精细结构的糖胺聚糖,其作为一种抗凝血药物广泛应用于临床。肝素结构中的特殊五糖序列与抗凝血酶(AntithrombinⅢ,ATⅢ)结合是其发挥抗凝血作用的关键,五糖序列中2-O硫酸化的艾杜糖醛酸(Ido A)是肝素与ATⅢ高亲和结合的重要位点。在肝素生物合成过程中,葡糖醛酸C5-差向异构酶(D-glucuronyl C5-epimerase,GLCE)将肝素结构中D-葡萄糖醛酸(D-Glc A)转化为L-艾杜糖醛酸(L-Ido A),其中D-Glc A连接在N-脱乙酰化/N-磺基转移酶(NDST)催化N-乙酰葡萄糖胺(Glc NAc)生成的N-硫酸化葡萄糖胺(Glc NS)残基的还原端。动物源肝素原材料来源受限,提取纯化过程易造成污染,而全化学法合成肝素耗费高、产量低,化学酶法是目前最具发展前景的一种体外合成肝素方法。化学酶法合成肝素需要重组GLCE与一系列磺基转移酶参与,其中GLCE是合成过程中的关键酶。然而目前通过组织提取或重组表达的GLCE得率和酶活力较低,不能满足化学酶法对GLCE的需求,因此制备高效稳定的重组GLCE是体外合成肝素类药物的关键。本研究通过构建重组慢病毒质粒成功原位表达了人源GLCEventriculostomy-associated infection(hGLCE),研究表明,其酶活性受二硫键和N-糖基化修饰的影响。此外通过研究其酪氨酸突变体发现,Y168、Y222、Y500、Y560和Y578可能为hGLCE催化活性位点。经优化hGLCE重组慢病毒质粒,以及慢病毒包装,感染,分离纯化等步骤后获得的hGLCE酶活力达到1.60 IU/mg,是目前文献报道的酶活力最高的重组GLCE。课题组Lorlatinib molecular weight前期从白玉蜗牛中分离得到的一种类肝素糖胺聚糖——白玉蜗牛多糖(White Jade Snail Polysaccharide,WJSPS),其结构中不含有Glc NS并且DGlc A完全差向异构化为L-Ido A。由此推测白玉蜗牛体内可能存在催化效率极高的GLCE,且底物Glc A不需要连接Glc NS,可直接被差向异构化,因此具有较高的研究意义和应用价值。本研究通过白玉蜗牛VX-765分子式c DNA文库克隆得到白玉蜗牛GLCE(WJSGLCE)基因序列,并利用昆虫表达系统表达得到重组WJSGLCE,为进一步研究WJSGLCE的酶活性和功能打下基础,同时为化学酶法合成肝素策略提供一种新型葡糖醛酸C5-差向异构酶。