里氏木霉在工业上广泛用于纤维素酶及其他异源蛋白的生产。据报道,其工业菌株纤维素酶分泌量可超过100g/L。同时,里氏木霉作为食品安全宿主菌,还具有发酵成本相对较低等优势。为了在里氏木霉中实现工业酶、食品蛋白和医药蛋白等重组蛋白的生产,构建高效的蛋白质表达系统非常必要。转录阶段作为蛋白质生产的第一步,对于蛋白质的产量十分重要,其中启动子作为转录阶段的重要元件是实现基因高水平转录的关键。因此,本论文分别针对里氏木霉中在葡萄糖阻遏条件下效率最高的强启动子Pcdna1、诱导条件下效率最高的启动子Pcbh1进行了改造,以期获得更为高效的启动子突变体用于目标蛋白的表达。本论文主要研究结果如下:1.启动子Pcdna1的设计改造里氏木霉中基因cdna1编码一种功能未知、高表达的碱性小蛋白,其启动子经常被用于重组蛋白生产。然而,由该基因启动子Pcdna1驱动的蛋白质的生产水平仍需提高。本论文发现起始密码子上游600-700 bp的区域对启动子Pcdna1的驱动能力至关重要。将该区域的拷贝数增加到3个时,异源β-甘露聚糖酶的产量提高了 37.5%。对几种培养条件的筛选显示,启动子Pcdna1具有受温度影响的特点。与30℃培养相比,37℃培养条件显著提高了由其驱动表达的β-甘露聚糖酶活力。最终结合启动子工程、多拷贝基因插入和培养温度控制的策略,在摇瓶中获得了产量为199.85 U/mL的β-甘露聚糖酶,达到了优化前的6.6倍。这些研究结果促进了对启动子Pcdna1性质的理解,并为提高里氏木霉中重组蛋白的产量提供了有效的策略。2.诱导型启动子Pcbh1的设计改造通过对里氏木霉纤维二糖水解酶I编码基因的启动子Pcbh1进行设计改造,具体包括增加纤维素酶转录激活因子XYR1结合位点、去除转录阻遏因子CRE1等的结合位点,得到了高效率启动子突变体Pcbh1XdC-1。使用Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在纤维素培养基中发酵144 h时,胞外β-甘露聚糖酶活力为349.88 U/mL。进一步在使用Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达的同时过量表达转录因子XYR1突变体,在纤维素培养基发酵96 h时胞外β-甘露聚糖酶活力为447.12 U/mL,在葡萄糖为唯一碳源的培养基发酵72 h时β-甘露聚糖酶活力为184.11 U/mL,均显著高于未过表达XYR1突变体的菌株。使用葡萄糖为碳源进行发酵,有利于进一步通过流加补料等方法继续提高目标蛋白的产量。3.基于转录调控元件改造的木质纤维素降解酶的高效表达将强启动子Pcbh1XdC-1和过表达XYR1突变体的菌株改造策略Anterior mediastinal lesion结合,实现了黑曲霉来源木聚糖酶在里氏木霉中的高效表达。工程菌株的木聚糖酶活水平达到了6195 U/mL,是出发株PX3的22倍,蛋白浓度接近8mg/mL。同时,将这一策略应用于里氏木霉https://www.selleck.cn/products/forskolin.html自身的内切葡聚糖酶的表达,纤维素培养基上酶活水平最高达到179.82 U/mL,是出发株h61同一条件下的3.7倍。在葡萄糖培养基条件下,工程菌株的内切葡聚糖酶活力可达到91.33 U/mL,是出发株h61同一条件下的3.3倍。木聚糖酶及内切葡聚糖酶的高效表达进一步证明强启动子Pcbh1XdC-MRTX849价格1和过表达XYR1突变体相结合有助于实现里氏木霉中蛋白质的高效生产。