卵巢癌(Ovarian cancer,OC)已成为一种严重威胁女性的癌症,其发病率年年递增。因发病隐匿,发现时2/3卵巢癌患者已达中晚期,往往还伴随远处转移,预后极差,复发率也高达70%。亟待寻找理想的治疗方案改善卵巢癌患者的现状。一直以来,西医治疗卵巢癌的标准方法是将肿瘤细胞减灭术与以铂类为基础的化疗相结合,但随之带来的手术创伤、药物副反应、铂类等化疗药物耐药也不容忽视。近年来,新型靶向药物的研究成为卵巢癌领域的新热点,多腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制剂就是卵巢癌靶向药物的典型代表。PARP参与细胞周期调节、细胞分化、细胞复制等多种生物学过程,其中最重要的是参与DNA单链的损伤修复。PARP抑制剂主要作用机制是阻止了肿瘤细胞单链DNA的自我损伤修复,造成复制分叉时DNA双链的断裂,若此时肿瘤细胞乳腺癌易感基因BRCA缺失,肿瘤细胞既无法进行同源重组修复,也无法依赖PARP单链修复,将对肿瘤细胞产生“合成致死”效应,导致肿瘤细胞的死亡。奥拉帕利(Olaparib)是目前应用最广泛,也是最早应用的PARP抑制剂。大量临床前瞻性及回顾性数据证实奥拉帕利可显著延长卵巢癌患者无进展生存期,尤其是存在BRCA1/2突变的卵巢癌患者获益最大,已被欧洲委员会批准用于铂敏感、BRCA1/2突变的高级别卵巢癌复发患者。然而,仅有5%～10%卵巢癌患者先天性BRCA1/2突变,如何扩大PARP抑制剂使用范围成为新的研究领域。有临床试验发现,PARP抑制剂与烷化剂等化疗药物联合治疗实体肿瘤,依靠烷化剂直接损伤DNA链,PARP抑制剂能取得协同增效的作用。资料显示,PARP抑制剂同DNA损伤修复抑制剂联用可使肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感性增加,改善PARP抑制剂的耐药性,协同抑制肿瘤细胞的生长。另有研究表明,血管内皮生长因子抑制剂能诱导同源重组修复相关蛋白BRCA1/2和RAD51的下调,若与PARP抑制剂联合使用,能增强PARP抑制剂的敏感性,且这种作用的发挥和BRCA状态无关。这些都为PARP抑制剂联合用药提供可行性依据。随着祖国中医药的发展,中药提纯技术的进步,中药经典方剂的挖掘及临床应用,让中药在疾病治疗方面不断进步。三年的新冠疫情更让中药得到了前所未有的重视,我们十分清楚地看到中药发挥的广阔天地以及未被发现的潜在价值。目前,西医治疗仍为主要方法,可以发挥中药多靶点、高效低毒、经济便宜的优势来辅助西医治疗。中医里没有“卵巢癌”这一诊断名称,但根据卵巢癌的临床表现可将之归于“癥瘕”“积聚”“石瘕”“肠蕈”等范畴。许多中医大家认为卵巢癌的病机为“正气不足”“正虚邪侵”,治法当以“扶正祛邪”为本,“扶正固本”或“益气清毒”为治法,所以治疗卵巢癌的中医方剂中大量使用补气类药物,尤以黄芪为重。因此,我们首选黄芪(Astragalus membranaceus,AM)作为研究的对象,目前关于黄芪治疗卵巢癌的分子作用机制、发挥抗癌作用的主要活性成分鲜少报道。本研究主要为三部分:首先,基于网络药理学方法,找到黄芪的主要活性成分;随后进行黄芪抗卵巢癌关键作用靶点的预测,通过蛋白质-蛋白质作用分析、富集通路分析及分子对接验证进一步对相关靶点优化;探究了信号通路;最终筛选出槲皮素(Quercetin)作为后续实验的主要研究对象。第二,随后进行体外细胞实验,探讨Quercetin单药及联合PARP抑制剂Olaparib对卵巢癌A2780、SKOV3细胞的抑制作用及潜在作用机制。第三,建立裸鼠皮下移植瘤,进一步验证Quercetin单药及联合PARP抑制剂Olaparib对卵巢癌活体肿瘤生长的影响,以及对同源重组修复通路上蛋白的表达影响,为Quercetin联合Olaparib治疗卵巢癌的进一步应用提供理论依据。第一部分基于网络药理学与分子对接探讨黄芪对卵巢癌的作用机制研究目的通过中药网络药理学研究黄芪所含有的各种有效活性成分、抗卵巢癌作用靶点、信号通路及药理机制。研究方法1、TCMSP获得黄芪主要活性成分,设定条件为OB≥30%,DL≥0.18和HL≥4h。2、Uniprot数据库获得黄芪主要活性成分的作用靶点。3、Gene Cards、DisGeNET、Open Targets数据库筛选卵巢癌的相关靶点。4、在线韦恩图Venny2.1.0取得AM-OC交集靶点。5、通过Cytoscape 3.8.0软件构建“AM-成分-交集靶点-OC”关系网络图,并筛选核心成分。6、通过STRING11.5数据库,绘制交集靶点的PPI网络图,加载到Cytoscape 3.8.0软件构建网络,使用CytoHubba插件、MCODE插件,筛选关键靶点。7、David数据库进行GO生物功能和KEGG通路富集分析,并筛选核心通路。8、AutoDock Vinal.1.2进行对接,PyMOL2.3.0分析对接结果的相互作用模式,验证核心靶点与活性成分之间的亲和力。研究结果1、获得黄芪活性成分和靶点、卵巢癌相关靶点,并筛选出“AM-OC”交集靶点:从TCMSP数据库获得AM成分87个,根据设定筛选出16个黄芪主要活性成分,184个对应作用靶点;检索GeneCards,DisGeNET和Open Targets数据库,选取各个数据库排名前149位的靶点;绘制韦恩图,获得“AM-OC”交集靶点共28个。2、黄芪抗卵巢癌的最核心活性成分是槲皮素:通过分析“AM-成分-交集靶点-OC”关系网络图,得到28个靶点关联了 14个成分selleck抑制剂,主要活性成分有槲皮素、山奈酚、芒柄花黄素、异鼠李素、毛蕊异黄酮,分别与24、9、8、8、7个靶点连接。槲皮素作为核心成分,将作为后续细胞和动物实验的研究对象。3、黄芪抗卵巢癌的关键靶点为P53、PTEN、VEGFA、MYC、AKT1、CCND1:通过“AM-OC”交集靶点的PPI网络图可视化分析,根据Degree值筛选出关键靶点,提示这些靶点可能是黄芪抗卵巢癌的潜在作用靶点。并用CytoHubba、MCODE插件再次进行了关键靶点的验证。4、黄芪抗卵巢癌的生物学功能丰富且通路众多,体现了黄芪“多成分-多靶点-多通路”的抗卵巢癌作用特点:利用DAVID数据库对28个共同靶点进行GO及KEGG富集分析,各筛选出排名前10的GO生物学功能条目和排名前20的KEGG通路富集分析条目,GO功能包括酶的调节、血管生成、氧化等,KEGepigenetic therapyG通路富集包括多种癌症通路,并构建出靶标-通路网络图。5、槲皮素与MYC结SAG合性最强、最稳定,结果间接证明槲皮素可对核心靶点发挥调控作用:核心靶点(TP53、PTEN、VEGFA、MYC、AKT1、CCND1)与核心成分槲皮素进行分子对接,结合能绝对值最大的为MYC与槲皮素,结合能为-8.1 kal/mol。研究结论1、网络药理学分析结果提示黄芪可以通过多个靶点和通路发挥抗卵巢癌的药效,这为卵巢癌的进一步抗癌研究提供参考。2、网络药理学分析结果提示槲皮素是对抗卵巢癌的最重要的黄芪活性成分,这为进一步的体外和体内生物实验提供了重要依据。3、通过GO和KEGG富集分析发现,黄芪抗卵巢癌作用的潜在通路多样且复杂。其中,癌症途径就涉及多个靶点。第二部分槲皮素联合奥拉帕利对卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖、迁移、凋亡的影响及潜在机制研究研究目的通过第一部分网络药理学和分子对接得出的黄芪抗卵巢癌核心成分—槲皮素,对卵巢癌A2780、SKOV3细胞生长进行干预,同时槲皮素联合奥拉帕利共同作用,探求两药联用抗卵巢癌的作用及机制。研究方法1、卵巢癌A2780、SKOV3细胞株体外培养。2、CCK8法检测Quercetin、Olaparib单药以及两药联用对SKOV-3、A2780细胞活力的影响。3、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测Quercetin、Olaparib单药以及两药联用对SKOV-3、A2780细胞凋亡的影响。4、划痕实验、transwell迁移实验检测Quercetin、Olaparib单药以及两药联用对SKOV-3、A2780细胞迁移能力的影响。5、克隆形成实验检测Quercetin、Olaparib单药以及两药联用对SKOV-3、A2780细胞集落形成能力的影响。6、蛋白质印迹法(Western Blot)检测Quercetin、Olaparib单药以及两药联用处理后 SKOV-3、A2780 细胞 DNA 修复相关蛋白(ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51、PARP1、OGG1)的表达水平,分析Quercetin以及联合用药对DNA损伤修复的影响,探寻作用机制。研究结果1、槲皮素、奥拉帕利以及两药联用抑制卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞的增殖:Quercetin、Olaparib抑制卵巢癌A2780、SKOV3细胞活性均呈剂量和时间依赖性,浓度越大,作用时间越长,抑制率越高。Quercetin和Olaparib联合用药处理的卵巢癌细胞抑制效果显著高于单一用药的抑制效果。2、槲皮素、奥拉帕利以及两药联用促进卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞的细胞凋亡:流式细胞仪检测后显示,Quercetin与Olaparib联合用药组凋亡情况以晚期凋亡为主,在两种卵巢癌细胞中联合用药组的总凋亡率均显著高于单一药物组。3、槲皮素、奥拉帕利以及两药联用抑制卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞的迁移:用细胞划痕愈合、transwell实验发现,与对照组及单药组相比,Quercetin与Olaparib联合用药能明显抑制A2780和SKOV3细胞迁移能力,联合用药后细胞划痕愈合最慢,划痕面积最大,且迁移细胞数目最少。4、槲皮素、奥拉帕利以及两药联用抑制卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞的克隆形成能力:克隆形成实验结果显示,Quercetin与Olaparib联合用药能明显抑制细胞集落的形成,大大降低了 A2780细胞、SKOV3细胞的克隆形成能力。5、槲皮素下调卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞的PARP1基因的表达:Western blot结果显示,与Olaparib相对比,Quercetin的处理降低了 A2780细胞和SKOV3细胞内PARP1蛋白的表达,同时,Olaparib处理增加了 PARP1蛋白的表达水平。在影响PARP1基因表达方面,两者作用相反。6、槲皮素以及两药联用抑制卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞同源重组修复相关蛋白(ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51)的表达:Western blot结果显示,与对照组相比,Quercetin可抑制同源重组修复相关蛋白(ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51)的表达,阻碍了同源重组修复的过程,与Olaparib联合应用发挥合成致死效应。7、槲皮素上调对卵巢癌A2780细胞和SKOV3细胞OGG1基因表达:Western blot结果显示,在A2780细胞中,与其他三组用药组相比,Que组上调OGG1表达,表达差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01)。在SKOV3细胞中,Que组上调OGG1表达,但各组之间表达差异不显著(P>0.05)。研究结论1、槲皮素、Olaparib单药可有效抑制卵巢癌A2780、SKOV3细胞的增殖,呈时间、浓度依赖性。2、槲皮素与Olaparib联合用药可增强单药对卵巢癌A2780、SKOV3细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移及细胞集落形成作用。3、槲皮素通过抑制PARP1蛋白表达和卵巢癌细胞的同源重组修复,与Olaparib联用对卵巢癌细胞发挥合成致死作用。第三部分槲皮素联合奥拉帕利对裸鼠卵巢癌移植瘤生长的影响及机制研究研究目的通过网络药理学和细胞实验已经证明槲皮素在卵巢癌中发挥重要的抑癌作用。为了验证槲皮素对在体卵巢癌肿瘤生长的影响,通过裸鼠皮下移植瘤实验来判断槲皮素以及槲皮素联合奥拉帕利对卵巢癌活体肿瘤生长的作用及作用机制。研究方法1、裸鼠接种A2780、SKOV3细胞进行成瘤实验。动态观察皮下移植瘤的生长状态,检测移植瘤体积及裸鼠体重变化。用药结束后处死裸鼠,将瘤体称重记录,并制成切片。2、采用HE染色观察移植瘤肿瘤组织形态,免疫组织化学染色检测槲皮素、Olaparib单药及联合用药后,各组裸鼠卵巢癌移植瘤组织中ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51、PARP1、OGG1蛋白的表达情况和表达定位。研究结果1、与对照组相比,各用药组卵巢癌移植瘤裸鼠的生长状态无明显差异:动物实验期间,各用药组成瘤裸鼠的体重增长,精神状态,饮食状况方面未见明显差异。2、槲皮素与Olaparib联合用药抑瘤作用最强:在A2780裸鼠卵巢癌移植瘤中,Olaparib组的抑瘤率为52.5%,Quercetin组的抑瘤率为35%,两药联用的抑瘤率为53.75%;在SKOV3裸鼠卵巢癌移植瘤中,Olaparib组的抑瘤率为27.27%,Quercetin组的抑瘤率为36.36%,Ola+Que组的抑瘤率为45.45%。与对照组相比,Quercetin与Olaparib联用组的肿瘤重量最小,差异有统计学意义(P<0.01)。3、槲皮素与Olaparib联合用药能明显抑制ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51在卵巢癌移植瘤组织中的表达:免疫组织化学染色结果显示:ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51蛋白在卵巢癌移植瘤中主要集中在细胞核表达,部分细胞质也表达。与对照组相比,槲皮素与Olaparib联合用药后,以上蛋白表达量明显降低,尤其是ATM、p-ATM、RAD51蛋白表达仅呈现少部分细胞核染色。4、槲皮素下调卵巢移植瘤组织中PARP1蛋白的表达:免疫组织化学染色结果显示:PARP1蛋白在卵巢癌移植瘤中集中在细胞核表达,与Olaparib相对比,Quercetin的处理降低了卵巢癌移植瘤组织内PARP1蛋白的表达,同时,Olaparib处理增加了 PARP1蛋白的表达水平。5、槲皮素上调卵巢移植瘤组织中OGG1基因表达:免疫组织化学染色结果显示:与对照组相对比,Quercetin的处理上调了卵巢癌移植瘤组织内OGG1蛋白的表达。研究结论1、动物实验证明,与单药相比,槲皮素与奥拉帕利联用对裸鼠体内卵巢癌细胞A2780、SKOV3皮下移植瘤生长抑制作用更强。2、槲皮素联合奥拉帕利可抑制移植瘤组织中PARP1、ATM、p-ATM、BRCA1、RAD51表达,发挥合成致死作用,且与肿瘤本身的同源重组状态无关。