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研究目的:瘙痒是一种不愉快的感觉,会严重影响患者的生活质量。最近的研究表明,G蛋INCB018424体内白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)可能在调节疼痛和瘙痒感觉中起关键作用。然而,GPER在初级感觉神经元中对瘙痒的调节作用仍不清楚。本课题旨在探究三叉神经节(Trigeminal ganglion,TG)神经元中的GPER是否以及Captisol溶解度如何参与瘙痒感觉的调节。方法和结果:首先通过免疫荧光染色结果表明,TG的GPER阳性(GPER~+)神经元在急性和慢性瘙痒中均被激活。行为数据表明,化学遗传学激活Gper-Cre小鼠TG的GPER~+神经元减轻了急性和慢性瘙痒引起的抓挠行为。相反,化学遗传抑制GPER~+神经元导致瘙痒行为的增加。此外,TG中GPER信号的表达和功能在干性皮肤诱导的慢性瘙痒小鼠模型中均上调。通过药理学抑制GPER或者基因敲除Gper均显著增加了小鼠的急性和慢性瘙痒相关抓挠行为。钙成像实验进一步表明,TG神经元中的Gper敲除导致瞬时受体电位A1(transient receptor potential,TRPA1)和瞬时受体电位V1(transient Oncologic pulmonary deathreceptor potential,TRPV1)激动剂引起的钙反应显著增加。结论:TG神经元的GPER通过调节TRPA1和TRPV1的功能参与急性和慢性瘙痒感觉的调节。本研究为外周瘙痒感觉信号处理机制提供了新的思路,为未来临床止痒治疗提供了新的靶点。

新城疫(Newcastle disease,ND)俗称“鸡瘟”,也称之为亚洲鸡瘟,是一种由副粘病毒科ND病毒(ND virus,NDV)引起的高度接触性的烈性传染病,被国际兽医局列为的世界A类疫病。目前,由于养禽业对新城疫疾病的疫苗免疫比较重视,一般情况下不会爆发典型新城疫。但是,由于养殖环境的改变,NDV的基因型在不断进化以及免疫鸡群受到强毒攻击等因素影响。近些年来,在免疫鸡群中发生的新城疫,往往表现出亚临床或非典型症状,发病率始终保持在15%-50%。发生非典型新城疫的不同日龄鸡易受到其他病原菌如大肠杆菌等微生物引起的内源性感染,致使雏鸡生产性能下降,育成鸡死亡率增加,给我国家禽业造成巨大的经济损失。因此,探究有效的方法来提高疫苗的免疫效果仍然具有重要意义。天然产物及其有效成分具有天然温和、安全高效和价格低廉的特点。同时,随着人们对食品安全和绿色健康的重视,应用中药等天然产物及其有效成分增强动物机体免疫已成为近年来的研究热点。本实验室前期研究表明,酵母细胞壁多糖能够通过提高鸡对新城疫疫苗免疫后的HI效价、肠道特异性s Ig A、Ig A+细胞数、脾脏及空肠免疫相关基因相对表达量来增强雏鸡免疫功能。酵母细胞壁多糖主要含有β-葡聚糖和甘露寡糖。因此,本研究拟进一步研究以β-葡聚糖为主要成分的酵母细胞壁多糖(G70)的免疫增强作用。通过体液免疫、细胞免疫和肠道免疫探究酵母β-葡聚糖(G70)对鸡免疫新城疫疫苗的影响,同时利用RNA-seq和RT-q PCR试验探索G70可能的作用机制,旨在为酵母β-葡聚糖(G70)作为免疫增强剂运用到临床以及酵母β-葡聚糖作用机制的理论研究提供参考。本研究包括以下试验研究内容:1.酵母β-葡聚糖(G70)对鸡体液和细胞免疫的影响试验选取48只1日龄雄性商品乌骨鸡(体重45±5 g)适应性喂养5 d后,按其体况大体一致的原则随机分为3组,H组、C组和S组,每组16只。生理盐水组(S组)和疫苗组(C组)饲喂基础日粮,G70组(H组)在饲喂基础日粮的基础上添加1 g/kg的酵母β-葡聚糖(G70)。分别于14、28日龄通过点眼滴鼻的方式进行ND疫苗进行首次免疫和加强免疫,生理盐水组则免疫相同剂量的生理盐水。试验期间,我们通过测定免疫器官指数,HA-HI法检测血清NDV特异性抗体水平,MTT法检测外周血淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量,RT-q PCR检测脾脏中免疫相关基因,探究G70对鸡体液和细胞免疫的作用。结果显示,酵母β-葡聚糖显著降低鸡法氏囊的器官指数(P<0.05),与免疫对照和生理盐水对照组相比,胸腺和脾脏的器官指数升高,但差异不显著。对于特异性抗体水平,在首次免疫后7 d、14 d(P<0.05)和二次免疫后7 d、14 d,G70组血清NDV特异性抗体水平高于免疫对照组。在二次免疫后7 d,与免疫对照组相比,G70组外周血淋巴细胞刺激指数显著升高(P<0.05)。同时,G70组外周血CD4+/CD8+T细胞比例显著上升(P<0.05)。另外,与疫苗对照组相比,G70组脾脏组织中IL-6(P<0.05)、TGF-β(P<0.01)和TLR5(P<0.05)的m RNA表达水平显著上调,而IFN-γ、TLR4、TLR3以及CD40、CD80和CD86的m RNA表达无显著变化(P>0.05)。2.酵母β-葡聚糖(G70)对鸡肠道免疫的影响本章实验利用HE染色显微镜下观察肠道绒毛结构,MTT法检测肠道淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测肠道CD4+T细胞和CD8+T细胞数量,RT-q PCR检测空肠中免疫相关基因,进一步探讨酵母β-葡聚糖对鸡肠道免疫的作用。结果显示,酵母β-葡聚糖显著提高隐窝深度(P<0.05)。在二次免疫后1周,G70组肠道淋巴细胞刺激指数显著升高与免疫对照组相比(P<0.05)。同时,G70组肠道CD4+/CD8+T细胞比例显著上升(P<0.05)。Medical disorder此外,与疫苗组相比,G70组肠道组织中GATA-3、MHC-I、MHC-II和CCR7的m RNA表达水平显著上调(P<0.05),而IL-6、TGF-β、NF-κB、TLR3、TLRCX-54614、TLR5、IFN-γ、CCR7、CCR9、J-chain以及CD40、CD80、CD86的m RNA表达无显著变化(P>0.05)。3.酵母β-葡聚糖(G70)对鸡脾脏基因表达的影响运用转录组测序技术分析脾脏中的相关基因和通路的表达谱差异,以阐明免疫增强作用机制。分别从G70组(H组)和疫苗对照组(C组)中随机选取4只乌骨鸡,收集脾脏做转录组分析,差异表达基因筛选标准为q<0.05。结果显示,H组与C组间共鉴定出198个差异表达基因,其中47个上调,151个下调。GO显著富集分析共有13个GO term,富集的GO term包括体液免疫反应、趋化因子反应、抗菌体液反应、对细菌的防御反应、由抗菌肽介导的对抗菌体液的免疫反应、对革兰氏阴性菌的防御反应、对革兰氏阳性菌的防御反应、线粒体呼吸链复合体I、NADH脱氢酶复合体、呼吸链、CCR趋化因子受体结合、趋化因子受体结合和脂多糖结合。KEGG富集分析中共有7条显著富集的代谢途径,分别为神经活性配体与受体的相互作用、缝隙连接、MAPK信号通路、ABC转运体、氨基酸生物合成、药物代谢和蛋白质的输出。此外,转录组测序结果显示13个DEGs显著富集在MAPK信号通路上。这提示酵母β-葡聚糖可能通过MAPK信号通路调节鸡脾脏的免疫反应。为进一步探究酵母β-葡聚糖的免疫增强作用机制,因此,采用RT-q PCR检测MAPK信号通路相关基因。结果显示,FAS和CACNA2的m RNA表达水平显著降低,MAPK信号通路其他相关基因表达水平变化不显著。综上所述,在基础日粮中添加0.1%酵母β-葡聚糖可显著提高新城疫疫苗免疫后鸡血清特异性抗体HI滴度、外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值和肠道的CD4+CD8+T细胞比例、促进外周血和肠道淋巴细胞增殖能力以及调节肠道和脾脏免疫相关基因的m RNA水平。此外,脾脏转录组共筛选出198个差异表达基因,差异基因共富集到13个GO term,7条KEGG代谢途径。提示酵母β-葡聚糖(G70)的免疫增强作用可能与上调脾脏中G-蛋白偶联5-HT受体和MHC类多肽相关的m RNA表达,抑制MAPK信号通路中的FAS和CACNA2基因相关。另外,有趣的是酵母β-葡聚糖能够显著下调抗菌肽和禽β-防御素等相关m RNA的表确认细节达。

柑橘是世界上最重要的水果之一,也是我国江西赣南地区的经济支柱产业,近年来,柑橘溃疡病对赣南脐橙产业的发展造成严重影响。柑橘溃疡病是一种细菌性病害,发病严重时会造成柑橘果树的落叶、落花甚至落果。目前用来防治该病害的化学药剂主要是铜制剂,虽然具有较好的防效,但是也引发一系列令人担忧的健康问题。植物内生菌的次级代谢产物是研制天然防治药剂的重要来源,本文以活性菌株间座壳属Diaporthe sp.HProtein CharacterizationT-79为研究对象,通过柱层析分离技术、波谱解析技术、MIC试验等对该菌株次级代谢产物进行分离纯化,筛选活性单体化合物,并挑选活性分子进行一系列抗菌机理研究。主要研究内容及结果如下:1、菌株间座壳属HT-79发酵粗提物及其萃取相的抗菌活性研究,对各个有机相进行MIC测定,结果显示,石油醚相的抗菌效果最佳,MIC值为0.625 g/L,其次为乙酸乙酯相,MIC值为1.25 g/L,因此后续先对石油醚相活性分子展开研究。GC-MS实验结果表明,在石油醚相中起到主要抗菌作用的物质是亚油酸,MIC值为0.078125 g/L,其次为油酸,MIC值为0.15625 g/L,后续主要研究亚油酸的一系列抗菌机理。2、生长曲线实验结果表明,亚油酸对病菌的生长有抑制作用,施药浓度越大,抑制效果就越明显;测定菌液还原糖变化时,发现亚油酸影响了病菌摄取碳源的能力;在胞外蛋白实验中,发现随着亚油酸施药浓度加大以及作用时间延长,测得的胞外蛋白含量要显著高于对照组,由此推测亚油酸通过破坏病菌细胞膜,使菌体内蛋白内容物流出;Z-IETD-FMK作用扫描电镜实验中也印证该猜测,亚油酸处理的菌体形态发生了显著变化,细菌表面出现凹陷、变形和破损的现象,而对照组仍保持相对完整的形态;同时ROS实验表明亚油酸刺激菌体产生过量的ROS,造成病菌细胞膜以及重要结构的氧化损伤,病菌发生不可逆转的的伤害而死亡。叶片实验表明,经过亚油酸处理的感病叶片病斑周围出现了空洞、凝结现象,病斑不再扩大,而对照组正常发病,出现柑橘溃疡病的典型特征。3、从石油醚相中还分离得到6个化合物,包括甾体类、生物碱类、环肽类化合物,其中化合物4和化合物6为新化合物。利用MIC实验对这6个单体化合物进行活性筛选,结果表明化合物4的抗菌效果较好,MIC值为0.015625 g/L。从乙酸乙酯萃取相中总共分离鉴定得到11个单体化合物,包含甾体类、含氮杂环类、酚酸类、吡喃酮类,其中化合物11、12为新化合物。MIC实验结果表明,抗菌效果最好的是化合物11,MIC值为0.015625 g/L,其次为化合物14,MIC值为0.0625 g/L,化合物12为0.125 g/L,化合物8、15为0.25 g/L。本文从间selleck抑制剂座壳属次级代谢产物中寻找抗柑橘溃疡病天然活性分子,为防治柑橘溃疡病绿色农药的研制提供先导分子及理论基础。

随着生活水平的提高,人们的饮食模式朝着低脂肪和低热量的方向发展。长期过量摄入高脂饮食会损害人体健康,诱发肝细胞脂质积聚、脂肪变性、炎症和纤维化等一系列肝损伤。高脂饮食诱导的肝损伤存在多种死亡方式,包括细胞焦亡和铁死亡等等。焦亡是一种炎症性细胞死亡形式,高脂饮食会激活NOD样受体家族pyrin域3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体,导致细胞内容物释放,最终引发肝损伤。铁死亡是一种新发现的细胞死亡方式,其主要特征是铁过载和活性氧(reactive oxygen species,ROS)积累。高脂饮食会增加脂质积累和脂质过氧化,进一步加速细胞铁死亡,最终导致肝损伤。因此,针对肝细胞焦亡和铁死亡,探究高脂饮食所致肝损伤的干预手段具有重要意义。自噬是一种依赖于溶酶体的降解途径,通常被认为是细胞响应多种应激的促生存机制,并参与了肝细胞损伤和死亡过程。芹菜素是一种存在于水果和蔬菜中的天然黄酮类化合物,已有研究证实其对肝脏具有保护作用。然而,目前尚未有研究探讨芹菜素对高脂饮食诱导的肝细胞焦亡和铁死亡的保护作用。因此,本论文利用高脂饲料喂养C57BL/6小鼠构建了高脂小鼠模型,同时利用棕榈酸(palmitic acid,PA)处理AML12细胞和Hep G2细胞构建了高脂细胞模型,研究芹菜素通过激活自噬缓解高脂饮食所致肝损伤的作用机制。主要研究内容与结果如下:(1)芹菜素通过激活自噬缓解高脂饮食诱导的肝细胞脂质积聚和损伤(1)研究芹菜素对高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠肝脏脂质积聚和损伤的影响,首先对C57BL/6小鼠肝组织的苏木精和伊红(H&E)染色、油红O染色和胶原纤维(Masson)染色情况进行观察,同时检测了小鼠的甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平。结果显示,高脂饮食组(high fat diet,HFD)小鼠的肝脏呈现明显的脂质积聚和典型的炎症及纤维化等肝损伤状态,同时小鼠肝组织TC、TG、AST和ALT水平也显著升高。然而,在芹菜素干预后,上述肝脏脂质积聚和损伤现象均得到明显缓解,同时肝组织TC、TG、AST和ALT水平也显著降低。以上结果说明,芹菜素能够缓解高脂饮食诱导的肝脏脂质积聚和损伤。(2)研究芹菜素激活自噬对高脂饮食诱导的C57BL/6小鼠肝脏脂质积聚和损伤的影响,首先对C57BL/6小鼠肝脏中自噬小体的数量变化进行观察,同时检测了自噬标志性蛋白LC3和P62的表达情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏中自噬小体数量增加,LC3和P62的蛋白表达水平上升,自噬被抑制。然而,芹菜素的干预进一步提高了LC3的蛋白表达水平,降低了P62的蛋白表达水平,激活了高脂饮食抑制的肝细胞自噬。接下来,在添加自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)后检测了小鼠肝脏脂质积聚和损伤情况。结果显示,CQ处理逆转了芹菜素缓解肝脏脂质积聚和肝损伤的作用,导致小鼠肝组织脂滴数量增多,TC和TG水平升高。同时,H&E染色结果显示,小鼠肝组织出现大量炎性细胞浸润和少量细胞核皱缩等典型的肝损伤状态,并伴随AST和ALT水平升高。以上结果说明,芹菜素通过激活自噬缓解高脂饮食诱导的肝脏脂质积聚和损伤。(3)研究芹菜素激活自噬对PA处理的AML12细胞和Hep G2细胞脂质积聚和损伤的影响,首先对AML12细胞和Hep G2细胞中自噬小体的数量变化进行观察,同时检测了自噬标志性蛋白LC3和P62的表达情况。结果显示,PA处理后AML12细胞和Hep G2细胞中自噬小体数量增加,同时LC3和P62的蛋白表达水平上升。然而,芹菜素的干预进一步提高了LC3的蛋白表达水平,降低了P62的蛋白表达水平,从而激活了PA抑制的细胞自噬。接下来,在添加CQ后检测了AML12细胞和Hep G2细胞中的脂质积聚情况。结果显示,CQ处理逆转了芹菜素的降脂作用。通过油红O染色观察发现,CQ处理后的细胞内脂滴数量增多,TC和TG水平升高。以上结果说明,芹菜素通过激活自噬缓解PA诱导的肝细胞脂质积聚和损伤。(2)芹菜素缓解高脂饮食诱导肝细胞焦亡的作用及机制(1)研究芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞焦亡的作用,首先对C57BL/6小鼠和AML12细胞中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素18(interleukin-18,IL-18)的释放情况进行了考察,同时检测了NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(cleaved-caspase-1)、消皮素D的N端(GSDMD-N)、IL-1β、IL-18的蛋白表达情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏和PA处理的AML12细胞中LDH、IL-1β和IL-18的释放增加,焦亡标志性蛋白和m RNA的表达水平升高。然而,芹菜素干预后明显改善了上述异常指标,使LDH、IL-1β和IL-18的释放减少,焦亡标志性蛋白的表达水平降低。以上结果说明,芹菜素能够缓解高脂饮食诱导的肝细胞焦亡。(2)研究芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞焦亡的机制,首先考察了芹菜素对线粒体自噬-ROS-溶酶体膜通透化(lysosomal membrane permeabilization,LMP)通路的影响。接着,对C57BL/6小鼠和AML12细胞中线粒体自噬关键蛋白磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase1,PINK1)和帕金森相关蛋白(Parkinson’s disease gene 2,Parkin)、溶酶体关联膜蛋白1(lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1)和组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的蛋白表达水平以及总ROS和线粒体ROS(mitochondrial reactive oxygen species,mt ROS)的积累水平进行检测,同时观察了吖啶橙(AO)染色和溶酶体追踪器(Lyso Tracker Red)的染色情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏和PA组AML12细胞中PINK1、Parkin和LAMP1的蛋白表达水平下降,ROS、mt ROS和CTSB的释放增加,AO和Lyso Tracker Red荧光强度降低,而芹菜素干预后显著改善了上述异常变化。随后,在分别添加了LC3-si RNA、线粒体自噬抑制剂环孢霉素A(Cyclosporin A,Cs A)、ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸乙酯(N-Acetyl-L-cysteine ethyl ester,NAC)、CTSB抑制剂CA-074甲酯(CA-074methyl ester,CA-074 Me)和NLRP3抑制剂MCC950处理细胞后,对焦亡指标以及NLRP3蛋白和CTSB蛋白的共定位染色情况进行检测。结果显示,LC3-si RNA和Cs A在一定程度上削弱了芹菜素缓解肝细胞焦亡的作用,而NAC、CA-074 Me和MCC950则促进了芹菜素缓解肝细胞焦亡的作用。以上结果说明,芹菜素通过线粒体自噬-ROS-LMP通路缓解https://www.selleck.cn/products/dorsomorphin-2hcl.html高脂饮食诱导的肝细胞焦亡。(3)芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞铁死亡的作用及机制(1)研究芹菜素对高脂饮食诱导肝细胞铁死亡的作用,首先对C57BL/6小鼠肝脏和AML12细胞中的Lillie染色情况以及线粒体变化进行了观察,同时检测了细胞内铁离子含量、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平以及铁死亡关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白重链(feEvolutionary biologyrritin heavy chain,FTH)、铁运蛋白(ferroportin,FPN)、长链脂酰辅酶A合成酶4(longchain acyl-coa synthetase 4,ACSL4)和转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,Tf R1)的表达情况。结果显示,HFD组小鼠肝脏和PA组AML12细胞中MDA、ROS、铁离子含量以及ACSL4和Tf R1的蛋白表达水平升高,GSH含量以及GPX4、FTH和FPN的蛋白表达水平下降,而芹菜素的干预显著改善了上述异常指标。以上结果说明,芹菜素能够缓解高脂饮食诱导的肝细胞铁死亡。(2)研究芹菜素对高脂饮食诱导的肝细胞铁死亡的机制,在分别添加了LC3-si RNA、Cs A、NAC、铁离子螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)和溶酶体膜稳定剂氯化铵(NH_4Cl)处理细胞后,对铁死亡指标以及PINK1蛋白和FTH蛋白的共定位情况进行了检测。结果显示,LC3-si RNA和Cs A能够削弱芹菜素缓解肝细胞铁死亡的作用,而NAC、DFO和NH_4Cl则进一步促进了芹菜素缓解肝细胞铁死亡的作用。以上结果说明,芹菜素通过线粒体自噬-ROS-LMP通路缓解高脂饮食诱导的肝细胞铁死亡。综上所述,本论文阐述了芹菜素激活自噬缓解高脂饮食所致肝损伤的作用,具体机制为芹菜素通过激活线粒体自噬-ROS-LMP通路缓selleckchem Ipatasertib解高脂饮食诱导的肝细胞脂质积聚、焦亡和铁死亡,从而缓解了肝损伤。本论文的研究为芹菜素在肝脏保护方面提供了新的研究思路,对保障人体健康具有重要意义。

研究背景:结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的传染病。天然免疫是宿主抵抗外界病原体感染的第一道免疫防线,巨噬细胞(macrophage,Mφ)具有强大的杀菌作用,其作为天然免疫的重要因素,在抗结核免疫中发挥举足轻重的作用。MTB可引起Mφ的多种死亡途径来实现免疫逃逸,其中包括坏死性凋亡(necroptosis)、铁死亡(ferroptosis)、焦亡(pyroptosis)等。因此,发掘能够对抗MTB感染所诱导的细胞死亡的药物将对于结核病患者的临床治疗具有重要意义。同时,鉴于耐药性结核病的不断出现,抗生素在治疗结核病方面面临着重大的挑战,寻找新型抗结核药物极具科学与现实意义。目前新药研发难度相对较大,因此老药新用的思路为药物研发提供了重要的手段。本课题从已上市批准以及药典收录的原料药物库FDA(Food and Drug Administration)药物库中筛选和挖掘具有抗结核作用的药物具有临床意义。研究目的与方法:1、RNA测序结合免疫印迹实验(Western blot)验证MTB感染引起的细胞死亡方式;2、利用CCK-8法检测细胞活力初步筛选FDA药物库中MDV3100 IC50对MTB感染Mφ起保护性作用的小分子药物;3、扫描电镜、透射电镜观察MTB感染小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)在顺苯磺酸阿曲库铵(Cisatracurium besylate,CIS)处理前后坏死细胞形态变化;4、免疫组化检测结核患者和慢性炎症病人肺组织坏死性凋亡相关selleckchem NN2211分子人混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)磷酸化水平;5、Western blot、CCK-8检测MTB感染BMDM使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1或激动剂RES与CIS同时处理细胞后坏死性凋亡相关分子磷酸化水平变化;6、免疫荧光技术检测MTB感染的BMDM在CIS处理前后MLKL易位情况;7、TNF-α+zVAD刺激L929细胞系建立经典坏死性凋亡细胞模型,Western blot、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测坏死性凋亡相关分子MLKL磷酸化水平及表达变化;8、药物亲和反应的靶点稳定性实验(DARTS)及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验验证CIS作用靶点及CIS处理前后坏死性凋亡相关分子间相互作用;9、分别构建MLKL、受体相互作用蛋白丝/苏氨酸激酶3(Receptor-interacting protein kinases 3,RIPK3)结构域质粒,DARTS及Co-IP实验验证CIS作用的蛋白分子具体结构域;10、沉默 RIPK3 上游分子 Z-DNA 结合蛋白(Z-DNA binding protein 1,ZBP1)、受体相互作用蛋白丝/苏氨酸激酶 1(Receptor-interacting protein kinases 1,RIPK1)、Toll 受体相关的干扰素激活蛋白(TIR domain-containing adapter-inducing interferon,TRIF),Western blot、CCK-8检测沉默相关基因后下游磷酸化水平变化,确定MTB感染Mφ启动坏死性凋亡的上游分子;11、在体内和体外分别构建CIS治疗MTB感染细胞模型、动物模型,检测CIS单独和(或)异烟肼联合用药后巨噬细胞杀菌效应;12、免疫组化、HE染色检测小鼠体内实验模型中肺组织p-MLKL水平及炎症浸润情况。研究结果:1、MTB感染可诱导Mφ发生不同类型细胞死亡;2、CIS抑制MTB感染Mφ导致的坏死性凋亡;3、CIS通过抑制RIPK3和MLKL之间的相互作用来抑制MLKL磷酸化;4、CIS抑制MTB感染Mφ的RIPK1/RIPK3和ZBP1/RIPK3坏死性凋亡信号通路,但不通过RIPK1或ZBP1和RIPK3之间的相互作用发挥作用;5、CIS在genetic parameter体外和体内对抗MTB感染均发挥保护作用。结论:本研究中,我们从FDA批准的药物库中筛选出CIS,研究显示在Mφ感染MTB时CIS对宿主表现出高度的保护性作用。我们首先通过转录组学测序同时结合死亡方式特征性蛋白表达检测、MTB感染前后Mφ形态学改变,证明CIS能够抑制MTB感染引起的坏死性凋亡,但对感染引起的其他死亡方式无影响。机制上,本研究发现CIS通过抑制坏死性凋亡相关分子RIPK3和标志性分子MLKL结合形成坏死性凋亡小体,从而阻止MLKL在胞膜上磷酸化和打孔,且CIS不影响MTB感染过程中RIPK3与上游分子RIPK1、ZBP1的结合。体内研究实验证明CIS在小鼠体内能够显著抑制胞内MTB的增殖,同时对于辅助一线抗结核药物异烟肼、利福平等的临床应用具有一定前景。

目的 构建基于铁死亡相关基因(ferroptosis-related genes, FRGs)的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoY-27632采购ma, HNSCC)预后预测模型并验证。方法 从TCGA和GEO数据库下载HNSCC RNA-seq数据及相关临床数据，分别作为训练队列和验证队列。从FerrDb网站提取共259个FRGs。利用单因素COX回归分析在训练队列中筛选与HNSCC患者预后有关的FRGs(P<0.01)。利用Lasso COX回归分析构建预后预测模型，并根据风险评分公式计算各临床样本的风险系数，然后使用Kaplan-Meier生存曲线和时间依赖性受试者操作特征(time-dependent receiver operating characteristic, time ROC)曲线评估该模型效能。同理，验证该模型在验证队列中的可行性和可重复性。最后采用单因素及多因此网站素COX回归分析对该Influenza infection预后预测模型进行独立预后分析。结果 训练队列中与HNSCC患者预后显著相关的FRGs共有12个，在此基础之上利用Lasso COX回归算法构建了11个FRGs构成的预后预测模型。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，高风险组的总生存率明显低于低风险组，差异有统计学意义(P<0.001)。time ROC曲线分析显示，该模型预测第1、3、5年总生存的曲线下面积(area under the curve, AUC)分别为0.649、0.729、0.688。独立预后分析显示，该评分模型可作为预测HNSCC的独立预后因素(P<0.001)。该模型在验证队列中得到了进一步验证。结论 本研究构建了11个FRGs的预后预测模型，且可作为HNSCC患者的独立预后因素。

目的:分析并确定ARCO 2-4期股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)对Harris评分有影响意义的MR征象。方法:回顾性分析2019年1月至2020年6月34例行常规MR、T2 mapping、3D-SPACE序列检查及Harris评分的ARCO 2-4期ONFH患者,排除3例,最终纳入31例,男23例,女8例,年龄18～62(40.0±10.8)岁;其中21例为双侧ONFH,共计52个ONFH,ARC0 2期17个,ARCO 3期24个,ARCO 4期11个。在医院数字影像信息系统(picture archiving aProtein Tyrosine Kinase抑制剂nd communication system,PACS)对MR影像征象(股骨头塌陷深度、ONFH指数、骨髓水肿、股骨头骨质增生、软骨损伤分级、软骨T2值及关节积液)进行评估及测量,在Siemens后处理工作站计算软骨定量参数T2值并测量。采用Pearson相关分析评估MR各征象与Harris评分的相关性,采用多重线性回归分析评估与Harris评分有相关性的MR征象对Harris评分的影响。结果:Pearson相关分析显示股骨头塌陷深度(r=-0.563,P=0.000)、软骨损伤分级(r=-0.500,P=0.000)及关节积液(r=-0.5 selleckchem D-Lin-MC3-DMA35,P=0.000)与Harris评分呈负相关。多重线性回归分析显示关节积液(β=-6.198,P=0.001)、股骨头塌陷深度(β=-4.0life-course immunization (LCI)85,P=0.014)对Harris评分呈负相关。结论:关节积液、股骨头塌陷深度对Harris评分有显著的负向影响关系,建议影像医师常规对股骨头塌陷深度、关节积液进行定量及等级评估,以高效精准地辅助临床诊疗。

背景:可卡因是一种具有中枢神经系统刺激作用的生物碱,具有极强成瘾性,其滥用是全球范围内的社会及健康问题。但可卡因的成瘾解毒缺乏有效治疗方式,通过高活性可卡因代谢酶快速将其代谢清除是目前有希望的解毒手段。可卡因体内半衰期短,经肝脏代谢后有约45%被水解为体内半衰期更长、毒性更强的苯甲酰芽子碱(benzoylecgonine,BZE),是可卡因长期毒性的主要源头。然而,现有的高效可卡因水解酶无法有效降解BZE,限制了可卡因中毒酶法治疗的实际效果。课题组在前期研究中首次证明细菌可卡因酯酶(bacterial cocaine esterase,Coc E)可将BZE降解为无毒的产物。对其进行初步改造,设计的Coc E五重突变体V116K/T172R/G173Q/L196C/I301C(命名为BZEase1)对于BZEMRTX1133体内的催化效率相对于野生型Coc E(wild-type Coc E,WT Coc E)有210倍提高(WT Coc E,k_(cat)/K_M=5.84×10~4min~(-1)M~(-1);BZEase1,k_(cat)/K_M=1.43×10~7min~(-1)M~(-1))。此外,BZE和重要的神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)具有结构相似性,Coc E被证实也可水解ACh,其潜在胆碱能副作用也是进一步开发所需考量的问题。因此,开发用于可卡因彻底解毒的BZE代谢酶不仅需对可卡因有毒代谢产物BZE具有高催化活性,还应提高其底物专一性。目的:基于“结构解析-催化机制研究-智能设计”迭代优化方案改造Coc E使其进一步提高对BZE的催化活性,降低对ACh的水解作用,提高Coc E的底物专一性,提升其用于可卡因彻底解毒治疗的成药性。方法及结果:1.基于野生型Coc E晶体结构和分子动力学模拟研究Coc E催化BZE水解的反应机理,确定了酰基化为反应限速步骤。分析活性中心关键氨基酸与底物在限速步过渡态的相互作用,用CHARMM构建突变体的初始坐标,计算各种突变体的近攻构象总氢键能。在之前设计的五重突变BZEase1基础上将Coc E-BZE结合模型中产物周围第51位丙氨酸(Ala51)突变为疏水性氨基酸可提升Coc E与BZE结合过渡态的稳定性,有希望提高催化效率。通过定点突变、表达和纯化突变体,高效液相色谱法检测Coc E水解BZE的产物苯甲酸(benzoic acid,BA)生成量对设计的5个突变体酶进行活性表征,证明将丙氨酸突变为亮氨酸(A51L突变)即A51L/V116K/T172R/G173Q/L196C/I301C(BZEase2)与BZE之间的亲和力提高了144倍,即K_M降低了144倍(BZEase2,K_M=35.7μM;WT Coc E,K_M=5153μM),k_(cat)提高了约3倍(BZEase2,k_(cat)=890min~(-1);WT Coc E,k_(cat)=301.2 min~(-1)),整体催化效率k_(cat)/K_M提高了427倍。通过突变BZEase2的催化三联体中117位丝氨酸并且除去跨亚基二硫键的L196C和I30medium entropy alloy1C两个突变,构建Coc E突变体(A51L/V116K/S117A/T172R/G173Q)与BZE进行共结晶,由于此突变体催化活性未破坏完全,最终得到分辨率为2.20(?)的Coc E-BA复合物晶体。该突变体结构与野生型酶结构没有显著的区别,活性中心关键残基构象与模拟结果一致,为我们的理论计算提供支持。2.BZEase2对体内BZE的代谢和清除在雄性SD大鼠中进行了表征。首先,尾静脉注射2 mg/kg BZE,1分钟后注射生理盐水或者0.2 mg/kg或1 mg/kg的BZEase2。在注射生理盐水或酶后不同时间点从股静脉采血75μL,并立刻与100μL 250μΜ对氧磷相混合以阻止BZE进一步降解。用已经建立的高效液相色谱检测方法对处理后的血样中BZE及其代谢物BA进行定量测定。结果表明,在大鼠体内,BZEase2剂量依赖性地加速BZE水解为苯甲酸和芽子碱。单次常规剂量的BZEase2(1 mg/kg,iv)可以在两分钟内消除几乎所有的BZE。3.通过野生型Coc E晶体结构以及得到的Coc E突变体-BA晶体结构,构建Coc E与ACh结合模型,动力学模拟和自由能计算解析了Coc E催化ACh水解的基本反应机制,确定去酰化过程是反应的限速步骤。基于ACh与BZE分子电荷分布和净电荷的不同,通过重新构建活性位点的静电环境,在五重突变体BZEase1基础上设计13个突变体,获得蛋白后测试它们对BZE和硫代乙酰胆碱(ATC,评价胆碱酯酶活性常用底物)的催化活性,进行初步筛选。结果表明将Coc E-ACh结合模型中不直接与ACh相互作用第51位丙氨酸(Ala51)突变为带正电荷的精氨酸(A51R突变,BZEase3)和赖氨酸(A51K突变,BZEase4)可以显著降低Coc E对ACh的催化效率,BZEase3和BZEase4在37℃反应条件下的胆碱酯酶活性CH-223191相对WT Coc E降低了1022和1328倍;对BZE的催化效率虽然相较于高活性突变体BZEase2有所降低,但相对WT Coc E分别提高了44和39倍;在BZE和ACh生理浓度下,三个突变体酶水解BZE和ACh的相对反应速率与WT Coc E相比,分别有14622、27139和34977倍的大幅提高。以上数据表明设计的突变体显著提升底物专一性,充分降低了对胆碱能系统的影响。结论:基于“结构解析-催化机制研究-智能设计”迭代优化方案,经过理性设计得到的Coc E六重突变体BZEase2(A51L/V116K/T172R/G173Q/L196C/I301C)水解BZE效率相较于野生型Coc E提高了427倍,并且单次注射常规剂量的BZEase2可以在两分钟内消除大鼠体内几乎所有的BZE,这为发展可卡因彻底解毒的BZE代谢酶提供更高的起点。通过引入A51R和A51K突变,重新构建活性位点的静电环境,大大降低代谢酶与ACh的结合能力,显著提高对BZE较ACh的催化特异性。设计的BZEase3和BZEase4对ACh的催化效率较野生型酶低1000倍以上,生理条件下对BZE较ACh的底物选择性提高～30000倍,因此显著提升BZE代谢酶的催化专一性,其胆碱能影响几乎可忽略不计。这项研究从催化活性和底物选择性角度改造Coc E,提升了其酶学性能,为实现可卡因彻底解毒提供了高效、专一的BZE代谢酶。

氮杂环化合物在生物学上具有广泛的应用,尤其是在医药研究和有机合成领域,它们的作用越来越重要。乙内酰脲及其衍生物是诸多含氮杂环物的一种,其存在天然化合物中的数量极其稀少,在如抗癌、抗炎、抗糖尿病、抗微生物、肾上腺素受体调节、抗惊厥、抗血小板和抗HIOrthopedic infectionV等方面具有显著的活性。因其具有的特殊活性,吸引着无数的科研学者进行研究。对于此类化合物的获取方法,目前常用的就是化学合成法,人们在研究含氮杂环化合物时发现,通过1,3-偶极子环加成反应是构建含氮杂环化合物高效简洁的方法。通常,此类反应为多组分反应,其原料具有价廉易得,操作安全等诸多优点。因此,在设计反应路线时,将[3+2]环加成关键技术引入,用来合成五元氮杂环化合物,并最终取得了较好的效果。本文主要研究内容如下:(1)首先对反应路线中所需要的两个辅料合成,根据文献所示方法,以D L-α氨基异丁酸为起始原料在氯化亚砜的作用下与甲醇合成了2-氨基异丁酸甲酯盐酸盐。4-氯-1-丁醇在咪唑与DMF作用下与TBSCl反应,进行羟基保护,合成氯代醚。之后,以4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲腈为起始原料与三光气反应合成3-三氟甲基-4-氰基苯异氰酸酯,筛选出最佳溶剂与缚酸剂,第二步是苯基异氰酸酯与Belumosudil分子量氨基酸甲酯发生[3+2]环加成反应制备芳基乙内酰脲,对其溶剂与碱进行条件筛选,第三步是芳基乙内酰脲与氯代醚进行乌尔曼C-N偶联反应,摸索出最selleck产品佳催化剂、配体、碱及温度。第四步进行羟基脱保护制备了RU58841,总收率为44%。之后在合成RU58841的基础上,以第二步关键中间体芳基乙内酰脲的为起始原料与溴乙腈发生乌尔曼CN偶联反应制备RU58642,单步收率为87.2%。并对每一步的反应机理进行介绍,并通过~1H NMR、~(13)C NMR及HR-MS对每一步产物进行了结构确证。(2)基于第一个工作的研究基础上,以4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲腈为起始原料与硫光气反应合成3-三氟甲基-4-氰基苯硫代异氰酸酯,然后3-三氟甲基-4-氰基苯硫代异氰酸酯与2-氨基异丁酸甲酯盐酸盐进行[3+2]环加成反应构建了芳基硫代乙内酰脲环,之后与氯代醚进行乌尔曼C-N偶联,最后用TBAF对羟基进行脱保护得到了RU 59063,该路线的总收率达到了61.5%。并通过~1H NMR、~(13)C NMR及HR-MS对每一步的产物进行了结构确认。本文通过[3+2]环加成技术构建了乙内酰脲环,并且通过一系列的反应合成了三个最终产品:RU 58841、RU 58642及RU 59063。本文的创新点在于:首先以固体三光气替代原路线中的光气,提高了反应的安全性;在进行[3+2]环加成时,用氨基酸酯替代了氰化物,反应条件变得更加温和,不需要对废液进行专门处理;在C-N偶联时采用乌尔曼C-N偶联催化剂加配体的形式,加快了反应时间的同时,又提高了收率。该路线操作相对比较简单、安全性比较高、反应效果良好。

目的 探究多发性骨髓瘤外泌体调控破骨细胞分化相关基因表达的功能及机制。方法 为了探究多发性骨髓瘤细胞对破骨细胞分化的影响，实验分为control组(THP-1细胞)、OPM2组(THP-1+OPM2细胞)、U266组(THP-1+U266细胞)、OPM2+GW4869组(Bio ceramicTHP-1+OPM2细胞+GW4869)和U266+GW4869组(THP-1+U266细胞+GW4869)。提取OPM2和U266细胞分泌的外泌体(OPMMLN4924抑制剂2 exo和U266 exo),透射电镜观察外泌体结构，Western blot鉴定外泌体标志蛋白TSG101、Hsp70、CD9。为了探究外泌体对破骨细胞分化的影响，实验分为OPM2 exo组(THP-1细胞+OPM2 exo)、U266 exo组(THP-1细胞+U266 exo)和PBS组(THP-1细胞+PBS)。qRT-PCR检测所有组细胞中活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATc1)、细胞原癌基因c-Fos、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)mRNA相对表达量，Western blot检测所有组THP-1细胞NFATc1、c-Fos、CTSK、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、动力蛋白激活蛋白4(dynactin 4, P62)蛋白表达量。结果 OPM2 exo和U266 exo粒径在100 nm左右，“杯托”样结构，并且表达标志蛋白TSG101、Hsp70、CD9。相比于control组，OPM2组和U266组THP-1细胞NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P<0.001),P62蛋白表达显著下调(P<0.001)。OPM2+GW4869组细胞NFATcIpatasertib1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著低于OPM2组(P<0.001),U266+GW4869组细胞NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著低于U266组(P<0.001)。相比于PBS组，OPM2 exo组和U266 exo组NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA和蛋白表达显著上调(均P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P<0.001),P62蛋白表达显著下调(P<0.001)。结论 多发性骨髓瘤细胞外泌体可能通过促进细胞自噬诱导破骨细胞分化。