原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)是骨髓增殖性肿瘤(MPN)的两个重要疾病亚型,是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。其主要发病机制为JAK-STAT通路的持续异常激活导致骨髓造血细胞的持续异常增殖,驱动基因突变包括JAK2突变、MPL突变和CALR突变。在2016WHO造血与淋巴细胞肿瘤分类的诊断标准中,血常规、驱动基因突变和骨髓病理是诊断MPN的主要依据。近几年,随着二代测序技术(NGS)的迅速发展,非驱动基因突变对MPN疾病进展和转化的影响越来越受到关注,其中,ASXL1、EZH2、SRSF3、Automated Microplate Handling SystemsIDH1/IDH2、U2AF1、CBL、K/NRAS被认为是MPN疾病进展和转化的高危分子突变(HMR)。对于不同的驱动基因突变,尤其是叠加不同的非驱动基因突变时,骨髓病理可能发生怎样的形态学变化,目前尚缺乏深入探讨。本研究通过分析ET和PMF患者中不同的分子背景和骨髓病理组织形态学之间的关系,初步探讨了骨髓病理在ET和PMF疾病分层和预后评估中可能具有的临床价值。第一部分ET和PMF患者中不同驱动基因(JAK2V617F、CALR)突变及风险分层对骨髓病理组织形态学的影响目的:通过收集ET和PMF(prePMF和overt PMF)患者的临床及实验室资料,分析JAK2V617F突变和CALR突变的ET、prePMF、overt PMF患者在年龄、性别、血常规及骨髓病理组织形态学中的差异。通过进一步对ET、prePMF、overt PMF患者进行危险度分层,探讨骨髓病理组织形态学对疾病评估的潜在价值。方法:1.收集自2017年1月至2019年12月在河北医科大学第二医院血液内科确诊的ET和PMF(prePMF和overt PMF)患者233例,包括ET 123例,PMF 110例(prePMF 51例,overt PMF 59例)。收集临床及实验室检查资料,包括年龄、性别、脾肿大情况、血常规、骨髓病理组织形态学特征(骨髓增殖程度、巨核细胞和巨核细胞簇的数量、裸核数量以及大巨核细胞和分叶不良巨核细胞所占比例)、驱动基因突变类型。2.对比携带不同驱动基因突变(JAK2V617F突变和CALR突变)的ET、prePMF和overt PMF患者在年龄、性别、脾肿大情况、血常规以及骨髓病理组织学特征有无差异。3.根据ET国际预后积分标准(IPSET-survival)对ET患者进行危险度分层,根据ET国际预后积分标准—血栓危险度分层(IPSET-thrombosis)对ET和prePMF患者进行血栓危险度分层,根据overt PMF动态国际预后积分标准(DIPSS)对overt PMF患者进行危险度分层,分析在ET、prePMF和overt PMF患者中,不同驱动基因(JAK2V617F和CALR突变)在不同分层下,患者临床和实验室特征的差异。结果:1.在ET患者中,JAK2V617F突变组在骨髓病理组织学特征中,巨核细胞数量、分叶不良巨核细胞所占比例均明显低于CALR突变组,其他未发现统计学差异(P=0.020,P=0.001,P>0.050)。2.在prePMF患者中,JAK2V617F突变组的白细胞计数明显高于CALR突变组(P=0.000)。在骨髓病理组织学特征中,JAK2V617F突变组骨髓增生活跃的患者比例以及巨核细胞数量均明显高于CALR突变组(P=0.002,P=0.020),其他未发现统计学差Puromycin异(P>0.050)。3.在overt PMF患者中,JAK2V617F突变组在骨髓病理组织学特征中,骨髓发生广泛纤维化的患者比例以及分叶不良巨核细胞所占比例均明显低于CALR突变组(P=0.022,P=0.001),而巨核细胞和巨核细胞簇的数量明显高于CALR突变组(P=0.014),其他未发现统计学差异(P>0.050)。4.根据IPSET-survival对ET患者进行危险度分层,在低危组,不同驱动基因突变的患者未发现统计学差异(P>0.050)。在中危组,JAK2V617F突变组在骨髓病理组织学特征中,分叶不良巨核细胞所占比例明显低于CALR突变组(P=0.016),在高危组,JAK2V617F突变组在骨髓病理组织学特征中,裸核数量明显低于CALR突变组(P=0.008)。进一步分析JAK2V617F突变的ET患者在高、中、低危三组中的差异,在骨髓病理组织学特征上,高危组分叶不良巨核细胞所占比例明显高于低危组(P=0.039)。低危组与中危组相比,中危组与高危组相比均未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析CALR突变的ET患者在高、中、低危三组中的差异,在骨髓病理组织学特征上,高GSK1120212 IC50危组裸核数量明显高于低危组(P=0.029)。低危组与中危组相比,中危组与高危组相比均未发现统计学差异(P>0.050)。5.根据IPSET-thrombosis对ET患者进行血栓危险度分层,低危组患者均为CALR突变,高危组患者均为JAK2V617F突变。在中危组,JAK2V617F突变组年龄明显小于CALR突变组(P=0.000)。在骨髓病理组织学特征中,JAK2V617F突变组分叶不良巨核细胞所占比例明显低于CALR突变组(P=0.000)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析JAK2V617F突变的ET患者在高危和中危组中的差异,结果显示,高危组患者年龄明显大于中危组(P=0.000),在骨髓病理组织学特征中,高危组增殖活跃的患者比例以及分叶不良巨核细胞所占比例均明显高于中危组(P=0.048,P=0.033)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析CALR突变组患者在中危和低危组中的差异,低危组年龄明显低于中危组(P=0.000)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。6.根据IPSET-thrombosis对prePMF患者进行血栓危险度分层,低危组患者均为CALR突变,高危组患者均为JAK2V617F突变。在中危组,JAK2V617F突变组年龄明显小于CALR突变组(P=0.000)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析JAK2V617F突变的prePMF患者在高危和中危组中的差异,结果显示,高危组患者年龄明显大于中危组(P=0.000),其他未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析CALR突变组患者在中危和低危组中的差异,低危组年龄明显低于中危组(P=0.000),其他未发现统计学差异(P>0.050)。7.根据DIPSS对overt PMF患者进行危险度分层,本组患者中,无低危患者,中危-1组中只有CALR突变患者1例。在中危-2组,不同驱动基因突变的患者未发现存在统计学差异。在高危组,JAK2V617F突变组在骨髓病理组织学特征中,分叶不良巨核细胞所占比例明显低于CALR突变患者(P=0.001),而巨核细胞数量明显高于CALR突变患者(P=0.019),其他未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析JAK2V617F突变患者在中危-1、中危-2和高危三组中的差异,结果显示中危-1组年龄明显低于高危组(P=0.015),血常规中的红细胞计数和血红蛋白明显高于高危组(P=0.003,P=0.002)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。中危-1和中危-2组相比,中危-2组和高危组相比,均未发现统计学差异(P>0.050)。进一步分析CALR突变患者,在高危和中危-2组中,未发现统计学差异(P>0.050)。结论:1.在ET和PMF中,JAK2V617F突变组和CALR突变组,在骨髓病理组织学特征上存在差异,提示在ET和PMF中,不同驱动基因突变可能对疾病的影响存在差异。2.根据临床常用的国际预后积分标准对ET和PMF患者进行分层对比,发现JAK2V617F突变和CALR突变可能主要对ET和overt PMF的中高危患者影响不同,但本研究中所采纳的骨髓病理组织形态学量化指标对ET、prePMF和overt PMF分层不够灵敏。第二部分在ET和PMF患者中CALRⅠ型/Ⅱ型突变的分子背景差异以及对骨髓病理组织形态学的影响目的:通过分析CALR I型/Ⅱ型突变的变异频率以及是否伴有非驱动基因突变,探讨不同的分子背景对ET和PMF的骨髓病理组织形态特征的影响。方法:1.收集2017年1月至2020年12月在河北医科大学第二医院血液内科确诊的携带CALR I型/Ⅱ型突变的ET和PMF患者77例,包括ET 25例、PMF 52例(prePMF 32例,overt PMF 20例),收集临床及实验室检查资料,包括年龄、性别、脾肿大情况、血常规、骨髓病理组织形态学特征和CALR突变类型。2.应用第二代测序技术(NGS)对本组77例ET和PMF患者进行38个热点基因突变检测(包括CALR,JAK2,MPL,ASXL1,EZH2,SRSF2,IDH1,IDH2,U2AF1,TET2,STAG2,BCOR,BCORL1,DNMT3A,CBL,CEBPA,MLL,SF3B1,ATM,GATA2,NRAS,KRAS,RUNX1,PPM1D,ZRSR2,KIT,SETBP1,NF1,TP53,NPM1,PDGFRA,PHF6,PIGA,SH2B3,FLT3,STAT3,CSF3R,WT1)。3.对比在ET、prePMF和overt PMF患者中,CALR I型和Ⅱ型突变患者在年龄、性别、脾肿大情况、血常规、骨髓病理组织学特征、驱动基因变异频率(VAF)以及伴随的非驱动基因突变是否存在差异,并进一步分析CALR I型和Ⅱ型突变的VAF以及非驱动基因突变对疾病亚型的影响。结果:1.在ET患者中,对比CALR I型和Ⅱ型突变,结果显示CALR I型突变的VAF值明显低于Ⅱ型突变(P<0.001)。在骨髓病理组织学特征中,CALR I型突变组分叶不良巨核细胞所占比例和裸核数量均明显高于CALRⅡ型突变组(P=0.000)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。2.在prePMF患者中,对比CALR I型和Ⅱ型突变,结果显示CALR I型突变的VAF值明显低于Ⅱ型突变(P<0.001)。在骨髓病理组织学特征中,CALR I型突变组分叶不良巨核细胞所占比例明显高于CALRⅡ型突变组(P=0.008)。其他未发现统计学差异(P>0.050)。3.在overt PMF患者中,CALR I型突变患者比例明显高于Ⅱ型突变,NGS结果显示CALR I型突变的VAF值明显低于Ⅱ型突变(P<0.001)。在骨髓病理组织学特征中,CALR I型突变组66.6%(10/15)患者出现广泛骨髓纤维化细胞消减,CALRⅡ型突变组100%(5/5)患者全部发生广泛骨髓纤维化细胞消减。其他未发现统计学差异(P>0.050)。4.在ET、prePMF和overt PMF三组患者中,共检测到23种非驱动基因突变,overt PMF患者出现非驱动基因突变的比例明显高于ET和prePMF。最常见的非驱动基因突变为表观遗传调节因子ASXL1、TET2和EZH2。5.在CALRⅠ型突变/Ⅱ型突变的患者中,对比携带同一CALR突变亚型的ET、prePMF和overt PMF患者的CALRⅠ型突变/Ⅱ型突变的VAF值,未发现有统计学差异(P>0.050)。结论:1.对比CALRⅠ型突变/Ⅱ型突变的ET、prePMF和overt PMF患者,CALR I型突变可能更容易导致MPN发生,但CALRⅠ型突变/Ⅱ型突变的变异频率不是导致发生不同疾病亚型的主要原因。2.本研究中,非驱动基因突变主要发生于overt PMF患者,可能深刻参与了CALRⅠ型突变/Ⅱ型突变的overt PMF的发生发展。