研究背景:尿道下裂是男性泌尿生殖系统最常见的先天性发育异常之一。近年来尿道下裂,尤其是重度尿道下裂的发病率升高,由于尿道下裂的患者术后并发症多,容易导致终身排尿和性功能困难,并增加心理问题的风险,给个人和家庭均带来严重的身心和经济负担。因此深入研究尿道下裂的发病机理,寻找早期诊断和治疗的新靶点十分重要。尿道下裂的发病通常被认为是一个多阶段和多因素的复杂过程,涉及到环境、遗传以及内分泌等复杂的交互作用。然而只有少数相关暴露个体最终发生尿道下裂,说明个体基因易感性也参与到了尿道下裂的发生发展过程。在人类https://www.selleck.cn/products/ve-822.html基因组计划取得巨大进步的背景下,以单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为基础,进行各种复杂疾病的遗传易感性研究取得了重要的进展,其中包括全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)和候选基因的关联分析(candidate gene association study)两种策略,关联分析已成为后基因组时代复杂疾病遗传学研究的热点之一。因此以SNP为切入点探索尿道下裂发病的机制研究,有望为尿道下裂的早期诊断开辟新的途径。胚胎发生学研究发现影响男性外生殖器的形成主要有三种分子途径:雄激素非依赖性,雄激素依赖性和依赖于内分泌和环境因素,而GATA4(GATA binding protein 4,GATA结合蛋白 4)-SRY(sex determining region of Y-chromosome)-Sox9(SRY related HMG box genes-9)的通路在男性性别决定的过程中起着决定性的作用,在性腺发育过程中,GATA4基因在发育的animal component-free medium性腺中高度表达。同时在MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)激酶信号的作用下,GATA4 蛋白磷酸化激活,其与 NR5A1(nuclear receptor subfamily 5 group A member 1)、FOG2 等蛋白协同作用,参与调节 SRY、Sox9 以及 AMH(Anti-Mullerian hormone,抗缪勒氏管激素)的表达。参与男性生殖器形成的任何阶段的基因的表达异常都可能导致泌尿生殖系统的畸形,包括了尿道下裂。因此,基于GATA4基因在性腺发育过程中的重要性,结合GATA4基因的产生过程以及作用方式,本课题选择GATA4为候选基因,筛选出GATA4基因与尿道下裂遗传易感性相关的SNPs,并对GATA4阳性SNP位点进行功能研究,分析GATA4的遗传变异引起尿道下裂的可能的分子机制,为尿道下裂的预防和治疗提供可靠的理论基础。第一部分.GATA4基因多态性与中国汉族患儿尿道下裂易感性的关联性研究研究目的:探讨GATA4上具有潜在功能性的尿道下裂易感性的多态性位点,通过统计学分析不同基因型与尿道下裂的发病及进展的关联性,验证GATA4的阳性SNP位点的不同基因型在体内的差异。研究方法:1.我们通过两阶段病例对照研究,采用TaqMan MGB方法对GATA4中4个潜在功能多态性位点(rs128458、rs12825、rs884662和rs904018)进行基因分型。2.采用单因素及多因素的Logistic回归评估不同基因型与尿道下裂发病风险的关联,并根据潜在的混杂因素进行调整。3.采用卡方检验评估病例与对照之间的人口学变量差异以及GATA4多态性位点在亚组间的分布差异。4.采用分层分析评估了阳性位点在不同临床类型的尿道下裂以及合并相应疾病的差异性。5.采用RT-PCR法检测在尿道下裂正常组织中验证阳性SNP位点rs128458A>T的不同基因型的GATA4 mRNA表达水平的差异。研究结果:1.在尿道下裂的患儿中,低体重儿和母孕期间补充雌激素的患儿比例明显比正常对照儿童(P<0.05),母孕年龄、母亲既往生育史、分娩时孕周期、叶酸的补充等因素在病例和对照研究中的分布频率无统计学差异。2.在两阶段的病例对照研究中,rs12458 A>T和尿道下裂的发病具有相关性,携带有TT基因型的患儿个体群罹患尿道下裂的风险明显升高(P<0.05)。而rs12825 C>G在一阶段的研究中与尿道下裂的发病具有相关性,而扩大样本量后无明显统计学相关性。3.携带有rs12458T等位基因的患儿以及携带有rs904018的GG/GC型基因型的患儿可能同时患有先天性心脏病及隐睾的风险升高,而其与尿道下裂严重程度无关。4.在尿道下裂组织中检测发现携带有TT基因型以及AT/TT基因型MG132细胞培养的GATA4 mRNA的表达水平明显低于携带有AA基因型组(P<0.05)。研究结论:].母孕期间补充雌激素以及患儿出生体重低体重儿是罹患尿道下裂的危险因素。2.GATA4基因的3'-UTR(3'-untranslatedregion)区域的多态性位点rs12458A>T中携带有T等位基因的患儿罹患尿道下裂的风险明显升高。3.在尿道下裂组织中,携带有rs12458A>T不同基因型的GATA4mRNA的表达水平有差异,与病例对照研究的结果呈正相关。第二部分.GATA4 rs12458 A>T基因多态性的功能学的初步研究研究目的:在体外研究GATA4 rs12458A>T基因多态性的功能学的初步研究,探讨GATA4-SRY-Sox9在尿道下裂发病中的可能机制。研究方法:1.分别构建含有GATA4 rs12458野生型(GATA4-rs12458A)和突变型(GATA4-rs12458T)等位基因的表达质粒转染入HEK293-T细胞中。2.采用实时定量逆转录酶PCR(Real time RT-PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测GATA4 mRNA和蛋白水平的变化,以及其下游基因SRY和Sox9的表达变化。3.划痕实验分析各组细胞的迁移能力,CCK8法检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平。4.最后将GATA4 rs12458野生型(A等位基因型)和突变型(T等位基因型)分别克隆进含有双荧光素酶报告基因的过表达载体,和hsa-miR-556-5p类似物共转染HEK293-T细胞,检测细胞中的荧光素酶活性。5.通过RT-PCR和Western Blot检测质粒和hsa-miR-556-5p共同转染进细胞后GATA4 mRNA和蛋白水平的变化。研究结果:1.GATA4rs12458突变型T等位基因组与野生型A等位基因组相比较,GATA4、SRY、Sox9的mRNA和蛋白表达的水平均明显降低,组间具有显著的统计学差异(P<0.05)。2.GATA4 rs12458突变型GATA4与对照组相比可明显抑制HEK293-T细胞增殖和迁移能力(P<0.05);突变基因型GATA4可在一定程度上促进HEK293-T细胞凋亡水平,但并无显著统计学差异(P>0.05)。3.荧光素酶报告基因的结果显示,hsa-miR-556-5p可以显著降低突变型T等位基因的荧光素酶活性(P<0.05),而对野生型A等位基因的荧光素酶活性无明显抑制作用(P>0.05)。4.在hsa-miR-556-5p干预下,突变型T等位基因组相较于野生型组的GATA4 mRNA和蛋白下降尤为显著(P<0.05)。研究结论:1.GATA4 rs12458A>T可以导致细胞中的GATA4、SRY、Sox9的mRNA和蛋白表达水平下降,抑制细胞的增殖迁移能力。2.GATA4 rs12458的突变型T等位基因通过增加了 hsa-miR-556-5p的结合位点下调GATA4的表达。3.has-mir-556-5p与GATA4 rs12458 A>T多态性的相互作用可能通过调节生殖发育中重要基因SRY和Sox9的表达来抑制细胞增殖和迁移,导致尿道下裂。